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淫羊藿苷通过AKT/P53通路抑制S-亚硝基谷胱甘肽诱导的内皮细胞凋亡

黄熹；项涛；徐石；陆森；刘辉；张维晨；项鹏辉；许攀峰

关键词：内皮细胞细胞凋亡淫羊藿苷

摘要： 目的观察淫羊藿苷(ICA)对S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)诱导的内皮细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法内皮细胞株EA.hy926由浙江大学提供,将细胞按整群随机抽样法,分成空白对照组、损伤组(GSNO组)、不同浓度(高、中和低浓度)ICA干预组(ICA组)以及蛋白激酶B(AKT)通路的蛋白酶抑制剂LY294002抑制高、中和低浓度ICA组.空白对照组为EA.hy926细胞于96孔板培养,未予任何干预;GSNO组为EA.hy926细胞于96孔板培养48 h后给予1 mmol/L GSNO处理;高、中和低浓度ICA干预组为EA.hy 926细胞于96孔板培养24 h后分别加入10、1和0.1 μmol/L的ICA预保护24 h,再给予1 mmol/L GSNO处理;LY294002抑制高、中和低浓度ICA组为EA.hy 926细胞于96孔板培养24h后分别给予高(10.μmol/L)、中(1μmol/L)和低浓度(0.1 μmol/L) ICA干预的同时加入1 μmol/L LY294002,再作用24 h后给予1 mmol/L GSNO进行干预.噻唑蓝染色(MTT)法测定各组细胞存活率.根据不同试剂盒要求,检测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)活性和线粒体膜电位.Western blot法检测各组细胞AKT/磷酸化AKT(p-AKT)、人抑癌蛋白53(P53)、细胞色素C(CYC)、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)/磷酸化eNOS(p-eNOS)以及procaspase-3/caspase-3蛋白表达水平.结果 (1)各组EA.hy926细胞存活率:GSNO组细胞存活率明显低于空白对照组(P＜0.01),而高、中和低浓度ICA组均明显高于GSNO组(P均＜0.01).(2)各组EA.hy926细胞LDH活性:GSNO组的细胞LDH活性明显高于空白对照组[(142.65±5.56) U/L比(50.01±3.42) U/L,P＜0.05],而高、中和低浓度ICA组则均明显低于GSNO组[分别为(98.02±3.52)、(105.29±6.89)和(117.16±4.27) U/L比(142.65±5.56) U/L,P均＜0.05],且降低LDH活性的效果具有浓度依赖性.(3)各组EA.hy926细胞MDA含量:GSNO组细胞MDA含量明显高于空白对照组[(11.14±0.37)nmol/mg比(5.21±0.18) nmol/mg,P＜0.05],而高、中和低浓度ICA组均明显低于GSNO组[分别为(6.60±0.41)、(6.83±0.21)和(8.29±0.07) nmol/mg比(11.14±0.37)nmol/mg,P均＜0.05].(4)各组EA.hy926细胞内ROS活性:GSNO组ROS活性明显高于空白对照组[(173.15±11.12)％比100％,P＜0.05],而高、中和低浓度ICA组均明显低于GSNO组[(122.56±8.09)％、(134.52±9.09)％、(149.89±9.16)％比(173.15±11.12)％,P均＜0.05],其中以高浓度ICA组尤为明显.(5)各组EA.hy926细胞线粒体膜电位:GSNO组线粒体膜电位明显高于空白对照组(0.84±0.04比0.12±0.04,P＜0.05),而高、中和低浓度ICA组均低于GSNO组(分别为0.57±0.08、0.63±0.02、0.66±0.04比0.84±0.04,P均＜0.05).(6)各组EA.hy926细胞内AKT/p-AKT表达:GSNO组细胞p-AKT蛋白表达水平明显低于空白对照组(P＜0.05),而高、中和低浓度ICA组则均明显高于GSNO组(P均＜0.05),且呈现浓度依赖性的趋势.而LY294002抑制高、中和低浓度ICA组p-AKT蛋白表达水平与GSNO组比较差异则无统计学意义.(7)各组EA.hy926细胞胞浆和胞核内P53蛋白表达:GSNO组胞浆和胞核内P53蛋白表达均明显高于空白对照组(P均＜0.05),而高、中和低浓度ICA组均明显低于GSNO组(P均＜0.05),LY294002抑制高、中和低浓度ICA组与GSNO组比较差异则无统计学意义.(8)各组EA.hy926细胞线粒体和胞浆内CYC、procaspase-3和caspase-3蛋白表达水平:GSNO组线粒体内CYC蛋白表达水平低于空白对照组(P＜0.05),而胞浆中却高于空白对照组(P＜0.05).高、中浓度ICA组线粒体CYC蛋白表达水平均高于GSNO组(P＜0.05),而胞浆中却低于GSNO组(P＜0.05),低浓度ICA组线粒体和胞浆中CYC蛋白表达水平与GSNO组比较差异均无统计学意义.各组procaspase-3和caspase-3蛋白表达水平趋势与CYC同.(9)各组EA.hy926细胞内eNOS/p-eNOS蛋白表达:GSNO组细胞p-eNOS蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义.而高、中和低浓度ICA组细胞中p-eNOS蛋白表达水平均明显高于GSNO组(P均＜0.05),但不同浓度组间差异无统计学意义.而LY294002抑制高、中和低浓度ICA组p-eNOS蛋白表达水平与GSNO组比较差异均无统计学意义.结论 ICA可抑制GSNO诱导的内皮细胞凋亡,其机制可能与ICA激活AKT通路从而下调P53活性有关.

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