宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一。人类乳头状瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染被证实是宫颈癌发生的必要原因,几乎100% 的宫颈癌中能检测到HPV感染。然而大多数妇女的HPV感染呈自限性,经过1~2年,HPV感染能够被机体清除。

  因此,怎样识别持续性感染并评估其发展成为高度上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)或宫颈癌的风险是宫颈癌预防和筛查的一个亟需解决的难题。

  本研究通过对宫颈病变中不同阶段患者的宫颈脱落细胞进行HPV亚型检测和HPV高危八型定量测定,确定各级宫颈病变中HPV感染的亚型分布和病毒载量情况,探讨HPV亚型和HPV病毒载量在宫颈病变发展中的作用以及意义。

  1 资料和方法

  1.1 资料在潮州中心医院就诊行液基细胞学检查(TCT)者,采用TBS分类法,结果异常的220位患者。年龄范围l8至64岁,平均年龄40.6岁。

  1.2 研究方法220例患者均行电子阴道镜检查和宫颈活检及HPV亚型检测和高危八型的病毒载量测定。

  1.2.1 阴道镜检查以及病理活检严格按照操作说明进行电子阴道镜检查,对可疑部位活检或同时行宫颈管搔刮术;阴道镜活检标本病理学检查由潮州市中心医院病理科医师完成。

  1.2.2 HPV-DNA分型测定用宫颈脱落细胞采集器于宫颈口采集表皮脱落细胞,运用凯普提取试剂盒按说明书严格操作提取DNA,采用MY09/MY11 通用引物扩增4O个循环,运用凯普HybriMax导流杂交和基因芯片进行HPV基因亚型检测。

  1.2.3 高危HPV定量测定经提取的DNA样本,应用中山大学达安基因股份有限公司的人乳头瘤病毒高危八型(16、18、31、33、45、52、56、58)引物在RocheLightcycler 480上对E6/E7片段进行扩增,通过环阈值的大小以及扩增效率计算样本的原始拷贝数。

  1.3 数据统计统计学处理采用SPSS13.0统计软件,以组织病理学检查结果作为金标准,将220个样本分为五个病理组。组问感染率比较采用卡方检验,组间的年龄均数比较采用方差分析。病毒载量与病理分级采用spearman相关性分析,经log转换后的病毒载量采用方差检验,年龄分组之间的病毒载量以及单纯感染和多重感染病毒载量以及病理分级的比较均采用Pearson相关性分析,P<0.05则认为有统计学意义。

  2 结果

  2.1 病理检查结果220位患者中,经阴道镜活检病理结果为慢性宫颈炎的患者32例、CIN1的患者60例、CIN2的患者60例、CIN3的患者32例、宫颈癌的患者36例。各病理组中年龄、HPV16检出率、总的HPV检出率、高危八型检出率以及病毒载量的分布见表1。

  2.2 HPV亚型检测在220例样本中,HPV感染192例(87.3%),包括18种基因亚型,其中HPV16是检出率高的亚型(50.91% ,112/220),且随着宫颈病变程度的增加,检出率逐渐增高。HPV58、HPV33、HPV52是仅次于HPV16的三个亚型,检出率分别为22.73%、11.82%、11.36%,在不同宫颈病变中感染率没有太大变化。HPV18型与宫颈癌的相关性仅次于HPV16亚型,在我们的研究中检出率仅4.54%,排第六。其他高危亚型(highrisk human papillomavirus,HRHPV)分布。192例HPV感染者中,63例检出两个或者两个以上的亚型,占总HPV感染的32.81%,其中三种常见的多重感染模式分别为HPV16和HPV58,HPVl6和HPV33,HPV16和HPV52。

  2.3 病毒载量通过实时荧光定量PCR检测,220例检测对象中182个样本检测为阳性,其中小病毒载量为1.13/mL,大为5.09×10mL,八个高危型HPV检出率与HPV分型的检出率基本一致。由于该PCR反应的线性范围为500~1×10/mL,我们将病毒载量小于500拷贝/mL的可疑阳性分为阴性组,并分阴性、低病毒载量和高病毒载量三个组与病理分级进行相关性分析。五个病理组问病毒载量具有显着差异,随着宫颈病变严重程度的增高,病毒载量逐渐升高,但相邻病理组间存在重叠。经两两比较,宫颈癌组要显着高于慢性宫颈炎组和CIN1组(P<0.005)年龄分组中,年纪大于35岁的妇女的病毒载量要明显高于年龄小于35岁的妇女。而单纯感染和多重感染之间的病毒载量没有明显区别。

  3 讨论HPV是属于乳头瘤病毒科的一种微小双链DNA病毒,对皮肤和粘膜上皮均能造成感染,其感染具有种属特异性。已经证实HPV是宫颈癌发生的必要原因,几乎100%的宫颈癌中能够检出HPV感染。

  在本研究中,有87.3%(192/220)的人被检出HPV感染,随着病理程度的增加,HPV阳性率逐渐升高,在宫颈癌中高,达94.44%,与之前的报道一致。 HPV16是宫颈癌中常见的亚型,也被认为是宫颈癌和癌前病变相关的致癌性强的亚型。我们的研究中,HPV16共检出112例(50.91%),且随着病理程度加重,HPV16的检出率逐渐增高,在宫颈癌组高(83.3%),而且无论是单纯感染还是多重感染,HPV16都是主导亚型。这与世界相关研究结果一致,表明HPV16在宫颈癌的发生和发展中起关键作用。

  HPV52和HPV58是亚洲特有的两个基因亚型,在中国、日本等亚洲国家有较高的检出,而在世界其他地区很少或者没有检出。HPV58在全国范围内都有较高的检出,而HPV52在中国东南沿海地区譬如浙江、福建、台湾、香港以及广东一些地区的人群中具有较高的感染率。之前在潮州进行的两项流行病学调查显示HPV52在该地区具有绝对优势,其检出率要高于HPV16和HPV58。而在我们的研究中,HPV52检出率仅11.36%,远低于此前对潮州的报道,这可能是由于目标人群的差异导致结果不同。

  之前还有研究显示HPV52在癌前病变的感染中高度流行,但很少在浸润性宫颈癌中检出。我们的研究结果为,HPV52的整体检出率不低,但在宫颈癌中仅检出5.56%,远低于HPV16。体外实验证实,HPV52的E6和E7基因体外转换能力有限,在宫颈癌中很少能结合到宿主基因而导致无限增值。这表明虽然HPV52在潮州地区人群中具有较高的流行优势,在癌前病变中的检出率不低,但是其致癌性相对较弱。

  HPV58同样是潮州地区一个高流行的亚型,已有研究显示HPV58次于HPV52排第二位或者第三位。我们的此项研究中,检出率达22.7%(50/220),排第二,仅次于HPV16,与相关研究一致。

  HPV18是宫颈癌相关的主要亚型之一,在世界范围内皆有较高的检出,本研究中HPV18检出率较低(4.54%),但是在宫颈癌中的检出仅次于HPV16,高于HPV52和HPV58。中国的大部分研究显示宫颈癌中HPV18的检出率仅次于HPV16。尽管HPV52和HPV58在潮州地区的HPV感染中占优势,但HPV16仍然是对宫颈癌的发生和发展重要的亚型,而HPV18虽然检出率相对较低,但在宫颈癌中仅次于HPV16,因此HPV18同样是宫颈癌相关的重要的亚型之一。同时,HPV58和HPV52作为该地区的优势,其在潮州地区HPV感染中具有显着优势,因此在潮州地区宫颈癌的防治以及癌前病变的筛查中仍然具有举足轻重的作用,如果第二代疫苗能覆盖HPV52和HPV58这两个特殊亚型,则能够显着提高该地区疫苗的覆盖率。

  细胞学检查作为筛查手段已经使子宫颈癌的发病率大幅下降,而HPV亚型测定作为一个细胞学检查附属的筛查方法使宫颈病变的早期筛查更敏感更有效率。但无论是发达国家还是发展中国家,宫颈癌仍然是一个重大的经济负担,对于HPV感染的监测和管理依旧存有许多困惑。病毒载量作为衡量病毒感染严重程度一个指标,一直被认为是可以作为确认C1N的严重程度以及评估发展为子宫颈癌的风险的潜在指标。许多研究表明,高病毒载量与宫颈病变的严重程度正相关,在指导ASCUS阴道镜的运用方面具有重要的意义,能避免一些过度的侵人性检查,尤其是HPV16。部分研究认为HPV16的病毒载量可以评估妇女进展为宫颈癌的风险或者提示一个较为良好的预后。但也有研究者认为病毒载量在识别妇女是否具有进展更高级别宫颈病变或者癌变趋势的作用有限,HPV感染过程中其他因素可能促进疾病的进展。年龄和多重感染是与子宫颈癌和HPV感染相关的危险因素。本研究结果显示,随着年龄的增长,HPV感染率逐渐升高,而年龄超过35岁的妇女的病毒载量比35岁以下的妇女中的病毒载量高。随着年龄的增加HPV感染的清除率减低,这也许可以解释年龄较大的妇女中HPV感染率和病毒载量较高的原因。而多重感染在我们的研究中占所有HPV感染的32.8l%,高于之前报道的24.01%以及中国整体的多重感染率28.98%。综合本研究表明,病毒载量与C1N以及子宫颈癌的严重程度呈正相关,随着宫颈病变严重程度的增加病毒载量逐渐升高。在病理组间,HRHPV的病毒载量有交叉重叠,虽然无法直接表明宫颈病变的严重程度,但高病毒载量仍然提示HPV感染的妇女进展为宫颈癌的风险较高,因此高危八型病毒载量仍然是一个潜在的确定子宫颈癌及癌前病变的辅助指标。