体外培养人牙周膜细胞方法的探讨_医学核心论文发表

时间:2018-03-21    来源:360期刊网    浏览:417

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【摘要】目的: 研究如何提高体外培养人牙周膜细胞(hPDL)的成功率,为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞,建立体外细胞模型提供一定的实验方法。方法: 利用3种不同方法(组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法)进行牙周膜细胞的原代培养,用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源;通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性。结果: 3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同;波丝蛋白抗体染色阳性,角蛋白抗体染色阴性。组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法。结论: 通过对牙周膜细胞培养方法的改良,可以显著提高hPDL原代培养的成功率。

    细胞体外分离培养是研究复杂的生物系统的重要手段,细胞培养条件下,将细胞从复杂的体内环境转移到较为简单的体外环境,可对细胞学研究中的变量进行分离和控制。上世纪70年代以来,国外学者对牙周膜细胞(Periodontal LigamentCells PDL)分离纯化进行了大量的探索和研究,且成功地从猴、猪、人等牙周膜分离培养出牙周膜细胞[1~3]。人牙周膜细胞(hPDL)分离培养主要有酶消化法和组织贴块法[4]。国内外学者对这2种方法评价不一,并且在这2种方法的基础上进行改进提出了酶消化组织块法和全牙消化法[5]。对组织块法、酶消化组织块法和全牙消化法这3种方法做了一些比较,以寻求hPDL体外培养的佳方法。

  1  材料和方法

  1.1  试剂及主要实验仪器设备

  α-MEM 培养液(Hyclone,USA),胶原酶(Type I,Sigma,USA),胎牛血清(杭州四季青),胰蛋白酶(配成0.25 %,过滤分装,冷冻保存),青霉素 100 U/ml,链霉素 100 mg/L;SABC 免疫组织化学试剂盒(武汉博士德),角蛋白抗体及波丝蛋白抗体(武汉博士德),二氧化碳恒温培养箱,倒置相差显微镜,血球计数板。

  1.2  方法

  1.2.1  组织块法培养hPDL

  (1)取材:选择健康青少年(12~18 岁)正畸拔除的健康的双尖牙,超净工作台内用刀片仔细刮除附着牙龈及根尖组织,用 D-Hanks液冲洗 3 次;(2)无菌处理:将牙冠浸入 5.25%次氯酸钠溶液中 2 min,再用含高浓度双抗的D-Haks液冲洗2遍。按照司徒镇强[6]传统组织块培养法进行原代培养;(3)传代:细胞汇合至培养瓶 80%时,用0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2消化传代。

  1.2.2  酶消化组织块法培养hPDL

  酶消化组织块法原代培养在取材、无菌处理上与组织块法相同。刮下根中 2/3 的牙周膜后,不剪,移入离心管内。0.1%胶原酶37 ℃消化30 min,其中,每5 min振荡1次,当肉眼观察到培养液略混浊,显微镜下见组织块松散时,离心,弃上清液,用含血清及双抗的培养基漂洗1次后弃上清液,收集组织块,将组织块平铺于培养瓶底,翻转培养瓶,向内加入 4 ml 培养液,置CO2培养箱孵育2 h,使组织块贴壁,再翻转培养瓶培养;传代与组织块法相同。

  1.2.3  全牙消化法培养hPDL

  全牙消化法原代培养牙周膜细胞取材、无菌处理与组织块法相同。将牙齿放入装有0.1%胶原酶的青霉素小瓶内,牙根向下,使消化液浸没牙根,37 ℃温箱内消化1 h,用吸管充分吹打牙根表面,加入等量含血清的培养基,离心,弃上清液,加入3 ml培养基(含10%胎牛血清、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 mg/L)吹打形成细胞悬液,移入25 ml培养瓶内,置CO2培养箱内进行培养,3 d换液1次,待细胞铺至瓶底80%时用0.25%胰蛋白酶1∶2消化传代。

  1.3  细胞的生长情况观察

  1.3.1  倒置相差显微镜连续观察细胞原代和传代生长情况。
  
  1.3.2  HE染色

  取生长状态良好的第5代细胞进行爬片,用苏木精-伊红染色,观察细胞形态。

  1.3.3  细胞免疫化学染色

  将培养的第3代hPDL接种于置有盖玻片的培养瓶中,按常规 SABC 法操作,进行波丝蛋白抗体、角蛋白抗体染色,光镜下观察染色情况。

  1.3.4  描绘细胞生长曲线

  取3块 24 孔板,分别取3种方法培养的第5代细胞,调整细胞浓度为1×104个/ml接种于 24 孔板,每孔100 μl,CO2培养箱内培养4 h后每孔加0.5 ml培养液继续培养,每天每组各取 3孔的细胞作细胞计数,连续观察8 d,绘制细胞生长曲线。
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