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多种一步法快速提取DNA对肺炎支原体PCR检测的影响

张军鸽;赵飞;刘立雍;马闪珊;单小云

摘要: 目的 对比不同一步法提取DNA在肺炎支原体PCR检测中的效果及应用范围,为临床标本中肺炎支原体的检测提供依据.方法 以两种经典的DNA提取一步法(ROSE和Chelex-100法)及其优化方案和商品化DNA提取试剂盒,提取肺炎支原体纯培养菌株及30份肺炎支原体阳性临床咽拭子标本DNA,分别进行普通PCR和荧光PCR检测,对比不同方法提取的DNA对PCR检测结果的影响.结果 ROSE法和Chelex-100一步法中的SDS严重影响Taq酶活性,提取物稀释100倍方可进行荧光PCR扩增,稀释10倍可用于普通PCR扩增.改良的Chelex-100一步法提取肺炎支原体纯菌DNA产量高,且PCR扩增效果好.对于30份临床标本来说,试剂盒法、改良Chelex-100法和水煮法的阳性率分别为100.00%(30/30)、80.00% (24/30)和43.33%(13/30),且对相同肺炎支原体阳性标本提取的DNA,试剂盒法检测的循环阈值(Ct值)比上述两种方法分别小1.95和2.38.结论 经典一步法提取的DNA必须经稀释后方可作为扩增模板.改良的C helex-100法操作简便,可用于纯菌培养的DNA提取.临床标本中肺炎支原体DNA提取以试剂盒法优,改良的Chelex-100法提取的DNA也可用于临床标本中肺炎支原体的检测,但不可用于定量分析.

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