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骨保护蛋白基因转染成骨细胞后的表达及对其生物学行为的影响

摘要: 目的 将人骨保护蛋白(OPG)基因转入体外培养的人成骨细胞,研究OPG基因在转染成骨细胞中的表达,并分析OPG基因转染对成骨细胞生物学行为的影响.方法 首先行人成骨细胞体外培养,然后用质粒peDNA3.1-hOPG转染成骨细胞,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测转染细胞OPG mRNA和蛋白质的表达.观察OPG基因转染后成骨细胞的增殖情况,对成骨细胞表达的碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)的含量进行检测,观察转基因细胞的生物学特性.结果 RT-PCR和Western blot检测结果表明在OPG基因转染后,成骨细胞表达的OPGmRNA和蛋白质含量均较未转染组增加.在OPG基因转染后,可明显促进成骨细胞的增殖,成骨细胞表达的ALP和BGP的含量均显著上升,而且在量效图中可以观察到随着OPG基因转染剂量增加,其增加程度也增加.结论 成骨细胞可作为转基因的受体细胞,成功表达目的 基因.转染OPG基因的成骨细胞可稳定、高效的表达OPG.OPG基因转染成骨细胞生物学特性稳定,而且可明显促进转染成骨细胞的成骨特性的表达.

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  • 富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2调控血小板源性生长因子受体β信号通路促进胶质母细胞瘤细胞周期进展

    作者:王宝峰;董民海;程芳玲;毛峰;肖群根;雷霆;郭东生

    目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)调控血小板源性生长因子受体p(PDGFRp)信号通路促进胶质母细胞瘤(GBM)细胞周期进展的机制.方法 免疫组织化学法检测肿瘤组织中蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期进展;裸鼠皮下移植瘤模型检测细胞在体成瘤能力;免疫荧光共聚焦及免疫共沉淀检测蛋白结合;Western blot检测信号通路蛋白表达.结果 人GBM组织中LRIG2与PDGFRβ蛋白表达呈正相关(x2=6.411,P<0.05).PDGF-BB刺激下,LRIG2过表达组S期及G2/M期细胞百分比均明显高于对照组[(22.74±1.23)%比(11.60±0.82)%,t=13.052,P<0.05;(19.06±1.04)%比(9.36±0.65)%,t=13.699,P<0.05].裸鼠皮下移植瘤LRIG2过表达组肿瘤体积明显高于对照组[(1372.56±167.88) mm3比(413.34±76.79) mm3,t=11.619,P<0.05].GBM细胞中LRIG2蛋白与PDGFRp蛋白存在共表达,且存在物理性结合.PDGF-BB刺激下,LRIG2过表达组U87细胞中PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化信号转导与转录激活因子-3(p-STAT3),细胞周期蛋白(Cyclin) B1和Cyclin D1表达水平均明显高于对照组.结论 LRIG2通过调控PDGFRp信号通路促进GBM细胞周期进展.

  • 肝纤维化过程中大鼠枯否细胞亚群及程序死亡1蛋白表达的变化

    作者:刘莹;闫德祺;王刚;袁紫林;吕文亮

    目的 探讨肝纤维化进展过程中枯否细胞(KCs)亚群与程序性死亡受体-1(PD-1)蛋白表达的变化.方法 取SD大鼠40只,随机数字表法分为对照组(16只)和模型组(24只).模型组大鼠皮下注射40% CC14/花生油1.0 ml/kg,每周2次,共计8周.对照组在相应时间皮下注射花生油.分别于1、2、4、8周每组各处死4只.(1)取出肝脏分别行苏木精-伊红(HE)染色及马松(Masson)染色,分析肝脏的病理变化及纤维化进程.以M1亚群抗体CD86和M2亚群抗体CD163进行免疫组织化学染色鉴别M1和M2细胞,检测不同时期M1和M2两个亚群与纤维化进程的关系.(2)分离培养纤维化不同时期的KCs,墨汁吞噬试验分析其吞噬能力的变化;流式细胞亚群分型检测肝纤维化进展过程中M0、M1和M2所占的比例变化趋势;免疫荧光检测肝纤维化进展过程中KCs PD-1蛋白的表达变化.结果 CCL导致了明显的肝损伤和纤维化,KCs吞噬能力逐渐减弱;流式结果显示模型组M1型KCs的比例在肝纤维化早期(1~2周)快速增加(0.250±0.016),显著高于M2型KCs(0.136±0.009)(P <0.05),第4周达峰后下降;M2型KCs的比例早期增加较慢,到后期(8周)时(0.325±0.023)超过M1型(0.224±0.017) (P <0.05).免疫荧光结果表明,模型组KCs PD-1蛋白表达第2周短暂下降后上升,第4周以后显著高于对照组(P<0.05).结论 在肝纤维化早期,M1型KCs比例占优势,对细胞的活化和募集发挥主导作用;而M2型KCs在M1型KCs的活化作用下持续增加,在肝纤维化后期超过M1型KCs,更直接地促进纤维化.KCs早期表达PD-1下降引起M1早期快速上升,参与了KCs亚群的分化和肝的纤维化.

  • 低表达人血细胞特异蛋白1相关蛋白X1对人结肠癌细胞增殖的影响

    作者:韩才顺;李海杰;吴安定;周宗进;罗学来;来森艳

    目的 观察低表达人血细胞特异蛋白1相关蛋白X1(HAX1)对结肠癌细胞增殖的影响.方法 利用HAX1特异性低表达小干扰RNA(siHAX1)瞬时转染结肠癌细胞SW48,通过Western blot验证低表达成功,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、克隆形成实验观察HAX1对SW48细胞的影响,利用Western blot检测细胞周期蛋白(Cyclin) D1表达.结果 Western blot证实在结肠癌细胞中低表达HAX1模型的成功建立,CCK-8实验结果表明,对照组(siCon) 48 h结肠癌细胞吸光度(A)值(1.264±0.020)较各实验组(siHAX1)A值(1.122±0.057、1.021±0.033、0.989±0.049)差异有统计学意义(P<0.05),即实验组增殖能力降低.72 h时,对照组A值(1.332±0.019),各实验组A值(1.199±0.040、1.081±0.022、1.068±0.026),组间比较差异有统计学意义(P<0.05),说明72 h时实验组增殖能力仍降低.克隆形成实验显示,对照组(siCon)克隆形成数目[(713±40)个]明显多于各实验组克隆形成数目[(422±33)、(558±37)、(505 ±23)个],且差异有统计学意义(P<0.05),说明实验组克隆形成能力降低.Western blot证实在细胞低表达HAX1蛋白后,可明显降低Cyclin D1蛋白的表达.结论 在结肠癌细胞中,低表达HAX1可通过抑制Cyclin D1的表达抑制肿瘤细胞增殖.

  • 小檗碱对梗阻性黄疸大鼠氧化性肝损害的保护机制

    作者:苗志钊;王建国;张生;邬善敏

    目的 检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)水平以及沉默信息调节因子1(SIRT1) mRNA及蛋白表达,探讨小檗碱(BBR)对梗阻性黄疸大鼠肝脏SIRT1基因表达的影响及其与肝脏功能保护的作用.方法 雄性Wistar大鼠45只,随机分为3组,每组15只,Sham组:假手术组,BDL组:胆道结扎组,BDL+BBR组:胆道结扎同时BBR干预组.实验结束时取血清检测总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT),取肝组织匀浆检测SOD、MDA、GSH水平,Western blot检测肝组织SIRT1蛋白表达,聚合酶链反应(PCR)检测肝组织SIRT1 mRNA水平,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)法检测肝细胞凋亡.结果 BDL组肝组织SIRT1 mRNA及蛋白、SOD、GSH[(0.13 ±0.01)、(0.16±0.02)、(243.49±27.52) U/mg、(27.42±4.39) mg/g]明显低于BDL+BBR组[(0.41±0.03)、(0.27 ±0.01)、(331.25 ±26.93) U/mg、(35.38 ±4.65) mg/g;P <0.01]及Sham组[(0.68±0.09)、(0.32±0.04)、(294.47±25.82) U/mg、(36.82±3.47) mg/g;P<0.01],ALT、MDA、细胞凋亡率[(235.63±13.34) IU/L、(0.92±0.27) nmol/mg、(13.00±0.04)%]明显高于BDL+BBR组[(148.27±13.98) IU/L、(0.61 ±0.09) nmol/mg、(6.21±0.02)%;P<0.05]及Sham组[(39.13 ±4.39) IU/L、(0.72±0.07) nmol/mg、(0.06±0.00)%;P<0.01].结论 BBR能减轻梗阻性黄疸氧化性肝损害,其通过上调SIRT1蛋白促进SOD基因表达,进而发挥抗氧化、抗凋亡作用.

  • p53调控信号转导与转录激活因子3信号通路对肺癌细胞增殖凋亡的影响

    作者:丁志丹;方泽民;王跃斌;王旭广;夏宗江;赵凯;赵高峰

    目的 观察p53调控信号转导与转录激活因子3(STAT3)的调控关系,及对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响.方法 A549细胞分别转染p53、STAT3过表达质粒、si-p53 RNA和si-STAT3 RNA,采用Western blot法检测p53蛋白和STAT3蛋白的变化;A549细胞分别转染p53和STAT3过表达质粒,采用细胞计数试剂盒(CCK-8)方法检测细胞增殖,采用流式细胞术AV-碘化丙锭(PI)双染法检测转染后凋亡,Transwell法检细胞迁移能力和侵袭能力.结果 过表达p53能显著下调STAT3蛋白,敲低p53后显著上调STAT3蛋白,敲低p53后A549细胞增殖速度明显增加(0.448±0.034比0.328±0.011,P<0.05),过表达p53后能抑制细胞的迁移(73.3±8.82比133.0±14.5,P<0.05)和侵袭(63.3±8.82比108.0±11.72,P<0.05)能力,并且促进凋亡水平(11.0±2.082比4.0±0.577,P<0.05).同时过表达p53和STAT3能消除上述功能.结论 p53能负向调控STAT3的表达,从而抑制其增殖和凋亡能力.

  • 微小RNA-206抑制恶性胸膜间皮瘤细胞增殖的作用

    作者:石珍亮;张逊;孙大强

    目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-206对恶性胸膜间皮瘤细胞增殖的抑制作用及其机制.方法 在H513、H2052和H2373等3种不同恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞株中通过转染引入一种miR-206的分子模拟物来过表达这种miRNA:(1)通过结晶紫染色实验分析转染后的MPM细胞的增殖变化;(2)通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测与细胞周期稳态和凋亡相关的基因变化;(3)通过基因敲除实验和PCR分析miR-206抑制作用可能的分子机制.结果 (1)转染3d后,结晶紫实验量化分析提示在H513、H2052和H2373转染细胞组与对照组比较显著减少(570 nm吸光度值:0.406±0.196比0.682±0.042,0.192±0.181比0.587±0.264,0.178±0.056比0.794±0.276,P<0.05);(2)在转染48 h后,RT-qPCR检测结果显示促凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)、p53和细胞周期阻滞基因p27的表达水平显著升高(平均差异倍数:1.489±0.355,1.298 ±0.336,1.746±0.389,P< 0.05),而细胞增殖基因增殖细胞核抗原(PCNA)和抗凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)的表达水平显著减少(平均差异倍数:1.489±0.355,1.298±0.336,P<0.05);检测同时提示组蛋白去乙酰化转移酶(HDAC)基因活性受到抑制,miR-206过表达对HDAC4和HDAC6都有显著的负调控作用(平均差异倍数:0.984±0.271比0.442 ±0.149比0.520±0.193,P<0.05).(3)在HDAC4或HDAC6基因被敲除后,3种MPM细胞株均显示出明显的结晶紫染色生长阻滞(570 nm吸光度值:0.971±0.205比0.427±0.152比0.520±0.191,P<0.05),这种表现与HDAC活性受到抑制一致,提示HDAC4和HDAC6基因亚型可能是miR-206转染过程中调控MPM细胞增殖的主导效应因子.结论 miR-206过表达在恶性胸膜间皮瘤中起到抑制肿瘤细胞增殖的作用.

  • 微小RNA-122对骨肉瘤增殖和侵袭的作用及其机制

    作者:张翼;张岩;刘宏建;卢新昌;李甲振

    目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-122对骨肉瘤MG-63细胞增殖及侵袭的作用并探讨其机制.方法 miR-122体外模拟物(mimic)转染,构建miR-122上调表达模型,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法验证转染效果;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖率变化;细胞划痕试验检测细胞迁移能力变化;细胞体外侵袭试验检测细胞侵袭能力变化;Western blot实验检测性别决定区Y框蛋白2(SOX2)和基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白表达水平.结果 miR-122 mimic转染后,MG-63细胞中miR-122表达水平(3.83±0.45)较对照组(1.05±0.09)明显提高(P<0.01);miR-122 mimic转染后24h及48 h后细胞相对存活率均明显低于对照组(P<0.05);mimic组细胞相对迁移能力(0.47±0.04)较对照组(0.93±0.07)受到明显抑制(P<0.01);体外侵袭实验证实mimic组每视野下平均细胞数[(84.01±5.69)个]明显少于对照组[(122.30±8.11)个,P<0.05];Western blot实验证实mimic组细胞SOX2蛋白相对表达量(0.51±0.10)较对照组明显降低(1.10±0.04,P<0.01);mimic组细胞MMP-9蛋白相对表达量(0.40±0.06)较对照组(0.99±0.11)明显降低,差异有统计学意义(P<0.01).结论 miR-122表达上调可以抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力,可能与下调SOX2和MMp-9表达相关.

  • 脂肪干细胞移植对兔正张力皮瓣回缩率的影响

    作者:王付勇;姚永明;李腾飞;李华强

    目的 观察脂肪干细胞移植对兔正张力皮瓣回缩率的影响.方法 取新西兰大白兔16只,无菌条件下分别取腹股沟脂肪,酶消化法提取脂肪干细胞(ADSCs)并培养至第3代,流式细胞仪器检测特异性标志物,成脂、成骨诱导鉴定其分化潜能.对移植ADSCs行CM-Di I荧光染色.于兔臀背部制作正张力皮瓣,皮瓣表面设计2 cm×2 cm注射干细胞区域.将实验动物随机分为2组,实验组注射1 ×105UADSCs悬液1 ml,对照组注射同剂量的培养基.分别于第3、7、14天测量设计区域面积,计算回缩率;第14天处死动物,取移植皮瓣ADSCs注射区域组织行苏木精-伊红(HE)染色,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达,免疫组织化学法检测组织中CD31表达并计算微血管数量.结果 16只动物模型均成功,术后第7、14天实验组ADSCs注射区域面积回缩率分别为(24.84 ±4.67)%和(28.41±4.54)%,对照组为(30.22±3.35)%和(34.91±3.65)%,组间差异有统计学意义(t=2.650,P<0.05;t =3.160,P<0.05).实验组移植皮瓣组织中依CD31表达计算微血管数目为(8.63±2.00)个/视野,对照组为(5.13±1.13)个/视野,组间差异有统计学意义(t=4.320,P<0.01).实验组移植皮瓣组织中VEGF的含量为(213.95±26.05) pg/mg,对照组为(169.40±24.94) pg/mg,组间差异有统计学意义(t=3.500,P<0.01).荧光示踪可见ADSCs可在皮瓣皮肤组织成活.结论 移植ADSCs可于大白兔皮瓣中成活,并通过促进正张力皮瓣血管再生的方式,缩小皮瓣回缩率.

  • 特异性核基质结合区结合蛋白1在肺腺癌组织中的表达及其对肺腺癌细胞增殖、凋亡的影响

    作者:王明月;黄波;王思望;刘贞利;张瑞昌;郭嘉东

    目的 观察特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)在肺腺癌中的表达与临床特征相关性及其在肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡中的作用.方法 共收集2016年1月至2017年12月在锦州医科大学第一附属医院胸外科全部切除并存于标本保存中心的70例肺腺癌和15例癌旁组织标本(距肿瘤边缘≥5 cm).用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法对组织切片进行染色.构建SATB1-小干扰RNA(siRNA)绿色荧光表达载体并转染,用荧光显微镜观察转染效率;Western blot分析法测定其沉默效果;噻唑蓝(MTT)、Transwell和Wound-Healing Assay检测细胞增殖、侵袭和迁移活性,流式细胞术分析细胞凋亡率.结果 SATB1高表达于人肺腺癌组织(阳性率61%),在癌旁组织中低量表达(阳性率20%),表达量与分化程度呈负相关(P<0.01).转染SATB1-siRNA后,转染效率70%左右,SATB1在A549细胞中的表达降低(P<0.01),与阴性对照组相比,细胞增殖、侵袭和迁移能力显著减弱(P<0.01),凋亡率升高(P<0.01).结论 SATB1与肺腺癌的发病机制和发展明显相关.

  • 物理损伤主导促进小鼠肝脏肿瘤生长的研究

    作者:赵广银;苏乔;李雯雯;李武国;李文英;黄浩机;曹伟杰

    目的 观察物理损伤因素在无免疫调节因素的情况下,对小鼠肝脏肿瘤早期生长的促进作用.方法 以重度免疫缺陷NCG小鼠作为建模对象,建立两类肝脏肿瘤模型.模型一:脾脏注射人肝癌SMMC-7721-RFP-Luc2细胞,建立脾脏注射肝转移动物模型,其中实验组(n=7)物理损伤小鼠肝左外叶,对照组(n=6)无损伤;模型二:人肝癌SMMC-7721-RFP-Luc2细胞成瘤后组织块移植小鼠肝脏肝左外叶,建立组织块肝脏原位移植动物模型,其中实验组(n=7)物理损伤小鼠肝左外叶,对照组(n=6)无损伤.利用活体成像系统比较两种模型肝脏物理损伤与否与肝脏部位肿瘤生长速度的关系.结果 脾脏注射肝转移动物模型第11天行活体成像检测,物理损伤组小鼠成瘤率100%(7/7),对照组成瘤率60%(3/5),两组比较差异有统计学意义(P<0.05).组织块肝脏原位移植动物模型第7天行活体成像检测,物理损伤组小鼠成瘤率100% (5/5),对照组成瘤率66.7%(4/6),两组比较差异有统计学意义(P<0.05);第14天行活体成像检测,物理损伤组小鼠成瘤率100% (5/5),对照组成瘤率83.3% (5/6),两组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 物理损伤因素在无免疫调节因素的情况下,对小鼠肝脏肿瘤早期生长具有显著促进作用.

中华实验外科

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