戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)引起的一种经粪-口途径传播的病毒性肝炎，呈全球分布。根据全基因组序列分析，HEV可分为4个基因型 ：1型以缅甸株为代表，2型以墨西哥株为代表，3型以美国株为代表，4型以中国株为代表；其中1型和2型只感染人，3型和4型既感染人又感染动物。自1997年第一株动物HEV 猪HEV美国株分离以来，已在多种动物包括非人灵长类动物、啮齿类动物、家猪、野猪、鹿、鸡、马、牛、羊、狗、猫等体内检出HEV抗体，并在家猪、野猪、鹿、兔和鸡等动物体内检测到HEVRNA，提示HEV不仅在人类中流行，而且也存在动物宿主，可由动物传染给人。动物HE传染人的直接证据来自日本，在HE患者与食物剩余的野猪肉和鹿肉中检出同一HEV。这些研究结果使人们认识到HE是一种人畜共患病。

　　近年，我国研究人员首先在农场养殖兔体内分离出HEV 6，基因序列分析显示兔HEV与已知1-4基因型HEV差异较大并可能构成一个新的基因型。此外，兔HEV抗体能被人源HEV抗原检测出来，提示兔HEV可能与已知基因型HEV含有共同的抗原表位。

　　本实验室近在江苏散养家兔的胆汁标本中成功分离出兔HEV 。本研究选取一株兔HEV 毒株JS120(GenBank序列号：JQ065059)，通过制备兔HEV ORF2蛋白C端片段p166(aa452617，R166)及抗一R166的McAbs，进一步研究兔HEV与已知基因型HEV抗原表位的异同，为阐明兔HEV的人畜共患特征及戊型肝炎的诊断和预防提供依据。

　　1 材料和方法

　　1．1 抗原的制备将HEV缅甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美国株(AF035437)、中国株(AJ272108)和兔HEV毒株JS120(JQO65O59)编码ORF2 p166(aa452617)基因片段，插入PET28a载体(Pharmacia产品)构建重组质粒，转化大肠杆菌JM109菌株(Promega产品)，表达6His-ORF2融合蛋白p166，经镍柱(Pharmacia产品)纯化的融合蛋白分别命名为p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn和R166。

　　1．2 抗R166单克隆抗体的制备

　　1．2．1 动物免疫和细胞融合采用常规方法以R166免疫6～8周龄雌性BALB／c小鼠，共3次，每次免疫间隔2周。末次免疫后3 d，取免疫的小鼠脾细胞，在PEG4000的作用下与SP2／0骨髓瘤细胞以10：1的比例融合，加入已制备有饲养细胞的96孔板，以含20％胎牛血清的HAT培养液置37℃ 、体积分数为5％的CO培养箱中选择培养。

　　1．2．2 杂交瘤细胞株的建立 用所免疫的R166重组蛋白包被酶标反应板，采用间接ELISA法检测细胞培养板孔上清液，TMB底物显色，测定A 吸光度值，P／N>2．1判定为阳性。杂交瘤细胞筛选时，Rl66检测阳性，同时无关抗原His。HCV NS3重组蛋白检测阴性为预期McAb阳性孔。阳性孔细胞经23次有限稀释法进行亚克隆，至100％培养孔阳性，建立分泌McAb的杂交瘤细胞株，并将克隆化的细胞扩大培养并制备腹水，离心取上清，置一20 cIC保存。

　　1．2．3 McAb的类和亚类的鉴定及效价测定采用上述间接ELISA法以HRP标记的兔抗鼠IgG亚类抗体(KPL产品)及兔抗鼠lgM抗体为二抗(KPL产品)鉴定McAbs的Ig类别；收集小鼠腹水并进行l0倍系列稀释，采用间接ELISA法检测抗体效价。

　　1．3 HEV重组蛋白抗原表位分析

　　1．3．1 计算机辅助的序列分析从GenBank中提取一HEV缅甸株(M73218)、墨西哥株(M74506)、美国株(AF035437)、中国株(AJ272108)的基因组序列，同时本实验室自行分离鉴定兔HEV并测序，使用LASERGENE计算机软件系统(DNASTAR，Inc．美国Wisconsin)的MegAlign Progmm进行计算机辅助序列分析。

　　1．3．2 ELISA检测 用已知基因1。4型HEV和兔HEV ORF2 p166重组蛋白分别包被酶标反应板，加入不同杂交瘤细胞的培养上清，37℃孵育45 min，洗涤6次，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为酶标二抗，37℃ 孵育45 min，洗涤6次，以TMB为底物显色，测定A 值，P／N>2．1判定为阳性。

　　1．3．3，免疫印迹法(Western blotting)检测将基因1-4型HEV及兔HEV的p166纯化蛋白，经SDS。

　　PAGE后转至硝酸纤维素膜进行免疫印迹反应，以含5％脱脂牛奶TBST封闭2 h，洗涤3次后分别加入不同杂交瘤细胞培养上清，室温摇动2 h，洗膜3次，加入1：2 000 HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温摇动2 h，洗膜3次，加入DAB(二氨基联苯胺)显色，蒸馏水终止显色，摄像保存。

　　1．4 McAbs中和活性的鉴定采用前期建立的基于PCR的HEV体外中和试验，将制备所得的MeAbs腹水分别与100倍的HEV低感染滴度的基因1型、4型HEV及兔HEV混合，37 qc孵育1 h后接种单层PLC／PRF／5细胞，37℃孵育2 h，洗涤3次，按常规方法抽提HEV RNA，采用逆转录一套式聚合酶链反应法(RT-nPCR)检测HEVRNA，以PCR结果阴性判为中和试验阳性。

　　2 结 果

　　2．1 融合及筛选获得3株稳定分泌抗R166 MeAbs的杂交瘤细胞株，即1c 、6F。和IOD2。以R166检测阳性，His‘HCVNS3重组蛋白检测阴性，说明所制备的MeAbs是针对R166中HEV基因编码蛋白的特异性抗体。

　　2．2 McAb的类和亚类的鉴定及效价测定将3株杂交瘤细胞直立培养2周后收集上清，同时也制备腹水，经ELISA鉴定，1C 、6F。和IOD：类和亚类鉴定均为IgG1，6F 和IOD：腹水的抗体滴度均为1：10，1c，腹水的抗体滴度为1：10。

　　2．3 HEV重组蛋白抗原表位的分析2．3．1 HEV 14基因型及兔HEV p166重组蛋白序列分析 比较已知HEV14基因型代表株缅甸株、墨西哥株、美国株和中国株及兔HEV JS120株编码p166蛋白的核苷酸序列，同源性为74．2％～80．9％ ，但在氨基酸水平，同源性高达88．0％～94．0％ ，提示不同基因型的p166重组蛋白在氨基酸水平具备相当的保守性，有可能存在共同的抗原表位。从氨基酸位点的差异来看(如图1所示)，与p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn相比，R166有5个氨基酸残基的改变，分别位于81、125、130、155和163位点，提示兔HEV有可能存在与已知基因型HEV不同的抗原表位。

　　2．3．2 ELISA分析 采用已知4个基因型HEV的p166重组蛋白(p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn)和兔HEV的p166重组蛋白(R166)作为包被抗原进行ELISA检测。3株杂交瘤细胞株中，1C。和6F 与5种p166均反应；IOD 只与R166反应，而不与p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn反应。提示R166与已知4个基因型HEV重组蛋白p166含有共同的抗原表位，也存在R166特有的抗原表位。

　　2．3．3 Western blotting分析根据本研究中p166重组蛋白的氨基酸残基数目，p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chn和R166等5种重组蛋白的分子质量约为24 kDa，其SDSPAGE可见预期条带(图2)。将3株杂交瘤细胞分泌的McAbs分别进行western blot，1C 株和6F。株在5种重组蛋白泳道均出现特异性24 kDa棕色反应条带，IOD 株仅在R166泳道出现特异性24 kDa棕色反应条带，在其他泳道均无特异条带出现(图3)。3株McAbs的Western blotting检测结果与上述ELISA检测结果完全一致，再次提示R166与已知14基因型HEV含有共同的和不同的抗原表位。

　　2．4 McAb中和活性的鉴定基于PCR的HEV体外中和试验检测显示，3株McAbs均不能阻断基因1、4型人HEV及兔HEV对培养细胞的感染性，不具有中和活性，提示这3株MeAbs结合的抗原表位是非中和性表位。

　　3 讨 论由于缺乏成熟的HEV细胞培养模型，目前HEV诊断主要依靠基因工程表达的重组蛋白或合成肽作为HEV特异性抗体检测的包被抗原。HEV ORF2编码的结构蛋白由660个氨基酸组成，其c端的2／3部分含有多个具有免疫优势的B细胞表位，广泛应用于HEV感染的免疫诊断及疫苗研究。我们前期研究发现，HEV ORF2C端基因编码的一段含有166个氨基酸残基的重组蛋白(aa452617)，含有HEV构型依赖性中和抗原表位，用缅甸株p166Bur(1型)免疫血清能够交叉中和3种不同基因型的HEV毒株(1型巴基斯坦株、2型墨西哥株、3型美国株)，提示不同基因型p166含有共同的中和抗原表位。而后我们在抗原表位的分析研究中，分别制备出来源于第1、2、3和4基因型重组蛋白p166Bur、p166Mex、p166Us和p166Chn的MeAb，发现4种基因型存在共同的抗原表位和基因型特异性的抗原表位。