多种HIV B'/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达及免疫效果研究

为了解多种HIV B'/C亚型基因在复制型DNA疫苗中表达水平及对免疫效果影响,使用复制型DNA疫苗载体pSCK2,分别构建了7种含单种或多种HIV B'/C亚型基因gagpol、gp160和rtn(rev、tat和nef融合基因)的DNA疫苗质粒.免疫荧光检测表明,Gag、Gp160、Rev、Tat和Nef蛋白均能从相应7种DNA疫苗中表达,单基因表达质粒中的基因表达水平和双基因表达质粒中IRES上游的基因表达水平普遍较好.小鼠免疫后,Gag能诱发较高的抗体滴度,Gp160、Pol和RTN的抗体滴度很低;比较研究显示,Gag单独表达和Gag与RTN双表达的质粒均能诱发较好的Gag抗体反应,但Gag与Gp160双表达质粒免疫或含Gag、Gp160和RTN质粒联合免疫的Gag抗体反应均较弱.ELISPOT检测表明,7种DNA疫苗单独或不同组合方式免疫均能诱发针对Gag、Pol、Gp160、Tat和Nef的细胞免疫反应;单基因表达质粒单独免疫诱发的细胞免疫反应好,含gagpol和gp160双基因表达质粒单独免疫或与含其它基因质粒联合免疫诱发的Gag、Pol和Gp160细胞免疫明显低于含Gagpol或Gp160单基因质粒诱发的相应免疫反应,但诱发的Tat和Nef细胞免疫与相应单基因质粒免疫组无明显差别.本研究结果显示,不同表达构建体的多种HIV B/C亚型的基因gagpol、gp160和rtn均能从pSCK2质粒中较好地表达;不同基因结构和不同组合免疫的优化,特别是含gag和gp160基因疫苗联合免疫程序的进一步优化对提高其免疫效果是必要的.

中国牛病毒性腹泻病毒JZ05-1分离株全基因测序及分析

牛病毒性腹泻病毒为瘟病毒属成员,呈世界性分布并在乳/肉牛业中造成严重经济损失.本研究利用MD-BK细胞增殖一株分离于我国吉林地区的牛源牛病毒性腹泻病毒JZ05-1毒株,观察发现其具有典型的致细胞病变效应.使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别扩增覆盖基因组全长的八个片段并测序,拼接获得该病毒的全基因组序列长12 285核苷酸(nt),GenBank登录号;GQ888686.该病毒基因组具有编码多聚蛋白的一个11694 nt可读框,5'非翻译区(UTR)长387 nt,3'非翻译区长204 nt.分别分析BVDV JZ05-1的5'-UTR序列和全基因组序列,发现该病毒属于BVDV-2a亚型.BVDV-2型多数毒株之间的相似性约为96%,与JZ05-1全基因组序列相似性高的加拿大p11Q毒株和中国XJ-04毒株的相似性为90%和91%.因此,JZ05-1全基因组序列与BVDV-2型其他毒株的全基因组序列具有较大差异.

表达人高致病性禽流感病毒H5N1(安徽株)结构基因的DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫应答分析

本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案.首先优化并合成H5N1(安徽株)的血凝素基因(HAop)和神经氨酸酶基因(NAop)并证实其正确表达,再构建含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAwt、HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗质粒.随后,采用不同途径的体内电转法在第0周和第3周2次免疫Balb/C小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体)和细胞免疫应答(IFN-γ ELISpot)的特点.结果表明;含有优化血凝素基因(HAop)和优化神经氨酸酶基因(NAop)的DNA疫苗可以快速激发较强的免疫应答,尤其是细胞免疫应答;皮内电转所激发的体液免疫应答强于肌肉电转.本研究为新型H5N1疫苗的研发以及免疫方案的优化奠定了基础.

表达siRNA的重组腺相关病毒载体的构建和鉴定

腺相关病毒(AAV)载体介导的RNA干扰(RNAi)可在哺乳动物细胞中长期特异性抑制同源基因表达.本研究以AAV Helper-Free System中的转移质粒pAAV-MCS为基础,引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和H1启动子,将该质粒改造为可表达小干扰RNA(siRNA)和EGFP的质粒pAAV-EGFP-H1.该质粒与辅助质粒共转染包装细胞后,获得了具有感染性的重组AAV(rAAV).以EGFP为靶基因的干扰实验证明;所得rAAV可以产生siRNA并能够特异性抑制EGFP靶基因表达;荧光显微镜观察、FACS分析和Real-timePCR方法均表明重组病毒rAAv-H1-shEGFP引起EGFP的表达降低大于60%.

XJ-160病毒单方向血清学反应分子基础研究

本研究通过基因替换和重组等技术构建重组病毒解释XJ-160病毒单方向血清学反应的分子基础.以实验室构建的XJ-160病毒全感染性克隆为基础获得XJ-160病毒和辛德毕斯病毒(SINV)糖蛋白基因单独和同时相互替换的重组病毒.首先研究重组病毒对细胞及动物感染性和致病性,同时利用微量细胞中和试验方法鉴定引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段.研究结果显示XJ-160病毒E2糖蛋白是影响病毒在细胞中的生长速率,空斑形态及对乳鼠致病性的主要因素.中和试验结果显示SIN病毒E2糖蛋白对决定引起XJ-160病毒单方向血清学反应起着重要作用.本研究确定了引起XJ-160病毒单方向血清学反应的基因区段,并为进一步研究XJ-160病毒基因组结构与功能打下了基础.

食用菌病毒脱毒方法的比较

应用dsRNA技术从平菇天达300(Pleurotus ostreatusTD300)菌丝中提取到4条dsRNA条带,大小分别是8.2、2.5、2.1和1.1kb.采用菌丝尖端脱毒法、原生质体再生法、冷冻真空干燥法和单孢杂交法进行脱毒,各得到一株脱毒菌株,分别是HTC8、PR15、FL01和SSH11.脱毒菌株HTC8仅残留有低含量的8.2kb dsRNA,PR15和SSH11完全脱去dsRNA,而FL01仍残留有低浓度的8.2kb和2.5 kb dsRNA.该4株脱毒菌株的菌丝生长速度和漆酶活力均比出发菌种有不同程度的提高,尤其是HTC8和PR15,菌丝生长速度比出发菌种分别提高22.73%和18.18%.漆酶活力比出发菌种分别提高145.83%和134.38%.综合比较此4种脱毒方法,菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法比冷冻真空干燥法和单孢杂交法脱毒效果好,制备脱毒菌株用时短、效率高.

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒.ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用.决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点.为了探寻新的抗病毒策略.本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系.Real-time PCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响.结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达.并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备.

针对NSP4基因的shRNA抑制牛轮状病毒的体外增殖

本研究根据牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)的NSP4基因序列,设计并构建了shRNA重组慢病毒载体RNAi-H1-89,利用脂质体介导法,将RNAi-H1-89与辅助质粒共转染293细胞,包装shRNA重组慢病毒;重组慢病毒感染MA104细胞24h后继续接种BRV,以针对LacZ基因的shRNA重组慢病毒为对照,48h后与LacZ shRNA对照比较,RNAi-H1-89明显抑制MA104细胞病变;RT-PCR检测结果表明,针对NSP4基因的shRNA可特异性抑制牛轮状病毒NSP4基因表达;病毒滴度测定表明,在转染50%、75%、95%RNAi-H1-89质粒的细胞培养上清液中,病毒滴度分别是对照组的50%、20%和10%.上述实验结果表明,针对NSP4基因的shRNA能高效地沉默NSP4基因,并且能阻断牛轮状病毒增殖.

流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A融合蛋白的表达及其免疫原性研究

本研究构建了表达甲型流感病毒M2蛋白胞外区与铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)融合蛋白的原核表达载体.根据铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)核苷酸序列设计突变PCR引物并实施突变PCR,以获得PEA基因编码区第553位氨基酸密码子缺失的突变PEA(ntPE),从而产生无毒性的PEA突变基因,然后用合成的M2e编码区替换ntPE基因中的非必需区Ib,产生ntPE-M2e嵌合基因.将该嵌合基因导入pET表达载体以构建原核表达载体,将表达产物胶回收后与弗氏不完全佐剂联合皮下免疫BALB/c小鼠.终免两周后用5个LD50流感病毒A/PR/34/8株进行攻击.取动物血清作ELISA并取脾脏作ELISPOT试验结果表明,免疫组可以诱导小鼠产生抗M2e特异性抗体反应和细胞免疫反应并能够抑制病毒在肺内的复制.本研究为甲型流感病毒广谱疫苗的进一步研发打下了基础.

HPV-2 E2蛋白(A338V)突变体对E2蛋白DNA结合能力增强的研究

HPV-2是引起皮肤寻常疣的常见HPV型别,病毒E2蛋白可抑制病毒早期启动子的活性.我们曾经报道来自一例巨大寻常疣患者的HPV-2突变E2蛋白对病毒早期启动子活性的抑制作用明显减弱,该E2蛋白在其C末端的DNA结合区域带有A338V的点突变.本研究利用原核表达系统表达纯化了突变E2(A338V)和HPV-2原毒株的羧基端和全长蛋白.电泳迁移率实验结果显示,E2蛋白可与带有E2蛋白特异性结合位点的寡核苷酸探针形成复合物,突变E2蛋白比原毒株E2蛋白的DNA结合能力强.这提示DNA结合能力的增强可能为E2蛋白对病毒启动子活性影响的分子基础,与患者出现罕见巨大寻常疣这一临床表型关联.

2005～2008年广东省诺如病毒胃肠炎暴发的分子流行病学特征

为研究广东省诺如病毒胃肠炎暴发疫情的分子流行病学特点.我们采集了2005～2008年期间24起急性暴发性胃肠炎患者的粪便和肛拭子标本,使用诺如病毒特异性引物,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行检测,再经核苷酸序列测定以分析诺如病毒的基因型,同时收集急性暴发性胃肠炎患者的相关流行病学资料.结果显示;24起急性暴发性胃肠炎中19起由诺如病毒引起,时间主要集中在每年的10月至次年2月,2005年病毒胃肠炎暴发疫情是由GⅡ-3基因型病毒引起,主要为幼儿园和小学,发生地主要在内陆山区,2006年秋季疫情以后则均为GⅡ-4型的变异株2006b引起,主要为大学和社区,2007年疫情数比其他年份高1倍,发生地遍及广东全省.广东省诺如病毒变异株2006b在个别特殊的基因位点呈现出高度的地域一致性.随着诺如病毒流行株的基因型由GⅡ-3变为GⅡ-4型,广东省诺如病毒流行的强度大大增加.新出现诺如病毒变异株2006b引起的暴发波及地方多,涉及人群从低幼儿童为主扩展到全年龄组.表明GⅡ-4新变异株比其它毒株具有更高的侵袭力.

一株H5N2亚型鹦鹉源禽流感病毒分子进化分析

2005年在广东进行流行病学调查时分离到一株鹦鹉源禽流感病毒,经鉴定为H5N2亚型禽流感病毒(A/Parrot/(Guangdong/268/2005).该毒株的HA裂解位点附近的氨基酸序列为RETRGLF,只含有一个碱性氨基酸,符合低致病性禽流感病毒的HA裂解位点附近氨基酸序列的分子特征;与H5N2亚型禽流感代表毒株相比,该毒株HA和NA基因的糖基化位点、HA基因的受体结合位点编码区、NA基因的耐药性位点均未发生变异.将该毒株全基因组序列与GenBank已公布的19株HSN2亚型禽流感病毒株的相应序列进行比较分析并绘制系统进化树后发现;其与低致病性禽流感毒株A/Pheasant/NJ/1355/1998(H5N2)-like的亲缘关系近,位于以A/Chicken/Pennsylvania/1/1983(H5N2)为代表的美洲进化分支.

H9N2亚型禽流感病毒广东分离株的全基因克隆及序列分析

本研究以一株2006年广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/HL/2006(H9N2)(简称Ck/GD/HL/06)为研究对象,用RT-PCR法扩增病毒基因组各片段(包括5'端和3'端的非编码区序列),将扩增片段进行克隆、测序并与参考毒株的相应序列进行比较分析,绘制各基因片段的系统发生树.分析结果表明,Ck/GD/HL/06株的HA基因同1997年中国香港鸭源毒株Dk/HK/Y280/97(H9N2)在同一进化分支,从HA的糖基化位点、受体结合位点等综合分析,该毒株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9亚型禽流感病毒的特点.HA的226位氨基酸残基为亮氨酸(Leu),具有同哺乳动物SAα,2-6受体结合的特性.Ck/GD/HL/06的PB1、PA和NP基因.同2004年越南分离的人源高致病性H5N1亚型流感病毒A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)株(简写A/VN/1203/04)的核苷酸序列一致性分别是93.8%、95%和96.8%,在先前的研究中未见有类似特性毒株的报道,而这种特性H9N2亚型AIV的出现,是否会增加在重组过程中产生新的高致病性H5N1亚型AIV的可能性,是值得我们关注的一个问题,也提醒在我国华南地区应更加重视防控H9N2亚型AIV,做好长期对H9N2亚型AIV监控及分子流行病学调查的工作.

中国狂犬病疫苗生产株CTN-1全基因序列分析

本文首次对我国现行狂犬病疫苗生产用毒株CTN-1进行全长基因组序列测定和分析,为CTN-1疫苗在我国实际应用中的优势提供理论基础.利用RT-PCR方法分段扩增CTN-1全基因组序列,随后将PCR产物克隆到T载体、测序、拼接,用MegAlign软件比较CTN-1全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组序列的同源性;再以糖蛋白(G)基因为模板,用ClustalX和MEGA4软件进行系统进化分析.测序结果表明CTN-1全基因组序列的长度为11 925nt(GenBank登录号FJ959397),序列分析表明CTN-1为基因I型;CIN-1株全基因组序列与国内外狂犬病疫苗株和街毒株全基因组之间的同源性是81.5%～93.4%;与美国蝙蝠分离株SHBRV 18的同源性低.仅为81.5%;与新近从中国国内分离的野毒株HN10株的同源性高,达93.4%.系统进化分析结果表明,CTN-1与国内不同地区大多数分离的狂犬病街毒株聚类于同一组内;而我国另一疫苗株aG株与国外疫苗株如Flury、PM、PV、ERA、RC-HL和个别中国街毒株分在另一组内.G基因氨基酸对比也显示CTN-1株与国内大多数街毒株的同源性高于其他疫苗株,结果说明CTN-1株较其他疫苗株病毒更适合制备用于预防中国狂犬病的灭活疫苗.

新疆阿克苏地区绵羊戊型肝炎血清流行病学调查

对新疆阿克苏地区8县1市7个品种的490份绵羊血清.采用双抗原夹心酶联免疫法检测抗戊型肝炎病毒抗体,比较不同行政区、不同品种及不同年龄段绵羊戊型肝炎病毒抗体阳性率的差异.结果显示,所检测血清总的抗体阳性率为28.98%(142/490)、8县1市的戊型肝炎病毒绵羊抗体阳性率依次为35.44%(28/79)、29.67%(27/91)、20%(4/20)、40%(12/30),32.5%(26/80)、38%(19/50)、22.5%(9/40)、8%(4/50)、26%(13/50),其中,沙雅县与各行政区之间差异极显著(P<0.01);2岁以上绵羊与1岁以下绵羊抗体阳性率依次为38.75%(31/80)和15.45%(17/110),差异极显著(P<0.01);不同品种绵羊呈现不同程度的阳性率,其中,蒙古羊与各品种之间差异极显著(P<0.01).由此可见,阿克苏地区所检测绵羊普遍存在HEV既往感染和潜在感染的可能性.

粘膜免疫细胞归巢与HIV感染

联合国2008全球艾滋病流行状况评估报告显示,全球艾滋病病(HIV-1)感染者人数仍呈上升趋势[1].中国现存的HIV-1感染人数估计从2001年的45万上升至2007年的70万,其中经粘膜途径感染的病例比例由2004年40.9%上升到2007年的51.6%[2-3],而在发达国家因粘膜途径传播而感染HIV的患者数更达到HIV总患者数的70～80%[1].

中国河北省卢龙地区猪札如病毒的基因多样性

札如病毒(Sapoviruses),先前称札幌样病毒(Sapporo-like viruses),属于杯状病毒科札如病毒属,是引起人、猪及水貂腹泻的重要肠道病原[1-3].札如病毒的原型株札幌病毒(Sapporovirus)是在1977年在日本札幌地区一次有婴儿的家庭中发生的胃肠炎暴发中被检测到[4].

《病毒学报》征稿简则

本刊来稿需注意的一些常用规范