本文是一篇专业的医学论文，主要是关于抗甲状腺药物治疗甲亢患者血清FT3、FT4、TSH、CRP、APN、β一m和fBG测定及不良反应影响因素探讨，详情请看下面的介绍

　　乏氧诱导因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)是一种关键的用于平衡氧稳态和调节缺氧反应的转录因子，是缺氧诱导基因转录信息传递的主要途径，其通过靶基因特定序列DNA的结合，调控有氧能量代谢、肿瘤血管生成、侵袭转移、细胞凋亡及放疗化疗抵抗等基因的转录。HIF-la主要由亚基和B亚基组成。机体或细胞在缺氧或乏氧的条件下可诱导HIFla高表达，HIF-1p为组成性的表达，几乎不受氧的调控。HIF-la的表达与胰腺癌肿瘤血管的生成、肿瘤的生长浸润转移有密切的相关引。本文探讨了用慢病毒载体介导的RNA干扰技术沉默HIF-let基因后对人胰腺癌Patu8988细胞体外增殖及细胞周期的影响。

　　1材料和方法

　　1．1材料与试剂人胰腺癌Patu8988细胞株由江苏省血液研究所保存。用含质量分数10％胎牛血清的RPMI1640培养基，置37％、体积分数5％CO的培养箱中培养，2d～3d传代1次。0．25％胰蛋白酶、胎牛血清购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基购自Hyclone公司，碘化丙锭(PI)、噻唑蓝(MrIT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司。其余试剂均为国产分析纯。BioRad酶联免疫检测仪购自德国BioRad公司，ELITE流式细胞仪购自美国BECKMAN-COULNTER公司。

　　1．2方法HIFla慢病毒干扰表达载体的构建针对HIF．1et基因序列(GenBank，编号NM001530，大小4082bp)，利用公用网站按照RNAi序列设计原则，合成干扰序列的正、反义链，在其两端连接上AgeI和EcoRI酶切位点粘端。用AgeI和EcoRI酶切pGCSIL．GFP载体以使其线性化，并在T4噬菌体DNA连接酶的作用下与退火的含干扰序列的双链DNAoligo进行连接反应。氯化钙法制备新鲜感受态大肠杆菌后，连接产物转化大肠杆菌，筛选含质粒的阳性克隆，测序比对后对针对HIF-let基因的RNAi质粒进行慢病毒包装，成功构建慢病毒介导的HIF一1aRNA干扰表达载体LV-RNAi-HIF-la。

　　1．2．1LV．RNAi．HIF-la的胰腺癌细胞转染消化Patu8988细胞接种两块6孔细胞培养板，每孔5×10个细胞，培养过夜。更换无血清、无抗生素的Opti-MEM培养基培养8h。配制转染复合物，RNAi靶点病毒转染组：100Opti-MEM培养基加入6HiPerFectTransfectionReagent和5lLVHIFletRNAi，阴性对照组：1001~lOpti．MEM培养基加入6pJHiPer．FectTransfectionReagent和5lNegativecontrolRNAivector，空白组：100~1Opti-MEM培养基。转染复合物配置完，室温静置10min，滴加到6孔板中，培养基总体积22001xl。转染12h后，将其中1块板置于37~C、体积分数0．5％O，行乏氧培养4h后仍常氧下培养，另1块板继续在常氧下培养，48h后进行实验。

　　1．2．2转染后胰腺癌细胞的体外增殖实验0．25％胰蛋白酶消化Patu8988细胞，用含10％胎牛血清培养液配成单个细胞悬液，调整细胞浓度后接种于96孔细胞培养板中，每孔1×10个细胞，培养过夜。更换无血清、无抗生素的OptiMEM培养基继续培养8h。实验分组同1．2．1，培养基总体积每孔100pd。转染24h后更换完全培养基。继续培养72h后每孔加入20l5mg／mlMTF溶液，37~C继续孵育4h，倾去上清液，加入200DMSO，充分混匀后，530nm比色。每组重复8孔，同时设DMSO空白对照。每组吸光度平均值一DMSO空白组=实际吸光度。

　　1．2．3流式细胞术分析细胞周期取生长良好的转染72h后的各组细胞，待细胞密度达80％～90％时，0．25％胰酶室温消化，使收集的细胞总数约1X10。，1000r／min离心10min，用冷PBS洗两次，缓慢加入一20~C预冷的70％乙醇固定细胞，充分振荡，4℃保存待测。上机测定前离心去除乙醇，用PBS洗两次，加100tLg／mlRNase200，37~C消化30min，PI50g／，rnl染色30rain，ELITE流式细胞仪488mn激发波长测定，用Lightcyce1分析软件分析细胞周期的分布。

　　1．3统计学处理应用SPSS17．0统计软件进行处理。数据均以±s表示，组间比较采用单因素方差分析和独立样本t检验，P<0．05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2．1HIF-la基因表达沉默对人胰腺癌Patu8988细胞的体外增殖能力的影响LV-RNAiHIF．1ct转染Patu8988细胞72h后，MTY检测结果显示，空白对照组吸光度为(1．053±0．010)，阴性对照组吸光度为(1．052±0．013)，两者比较差异无统计学意义(P>0．05)；LVRNAi．HIF-la转染组吸光度为(0．712±0．009)，与空白组及阴性对照组比较显着降低(均P<0．O1)。实验结果表明，LVRNAi．HIFl0能降低Patu8988细胞的增殖能力。如图1所示。

　　2．2 HIF-la基因表达沉默对人胰腺癌Patu8988细胞周期的影响Lightcyce1分析软件分析显示，LVRNAiHIFlet转染组Go／G期、s期和G2／M期细胞百分数与空白组比较差异有统计学意义(P<0．01)，表明LVRNAiHIFlot转染细胞后出现G。／G期阻滞，s期细胞百分数下降，细胞增殖受到抑制。如表1所示。3讨论胰腺癌的供血很差，在严重缺氧情况下还能继续增殖、侵袭转移的原因可能是持续的缺氧诱导了胰腺癌中HIFlet基因的表达。近年的研究结果显示，乏氧诱导因子1(hypoxia-induciblefactor1，HIF一1)作为转录调控因子起着非常重要的作用。HIF一1由HIF一10和HIF一1B组成，其中HIF．1仅是HIF表达和活性的主要单位，作为转录因子其可与多种靶基因结合调节其转录活性，介导组织细胞产生一系列的乏氧适应性反应。

　　本文用慢病毒载体LVRNAiHIF．1et介导的RNA干扰HIF-let后，细胞增殖MTY检测结果显示，LVRNAi．HIF．1ot转染Patu8988细胞72h后实验组吸光度(0．6554-0．049)较空白组(0．8594-0．168)和阴性对照组(0．830±0．168)有显着地降低(均P<0．01)，以及细胞周期实验LV．RNAi．HIF一10转染组G／G。期细胞百分数较空白组及阴性对照组明显增高，s期细胞百分数下降(P<0．01)，均表明细胞增殖受到抑制。

　　多项研究发现，在细胞周期的调控体系中，有多种因子参与，包括cyclinD1和cyclinE1在G0／Gl至s期转换中都起主要作用，它们在G期进入S期时均高表达，与肿瘤细胞侵袭力、转移密切相关u。因此，可以推断，HIF-la基因表达沉默影响细胞周期阻滞在G／G期的主要机制可能是下调了cyclinD1的表达，从而阻滞了胰腺癌Patu8988细胞G。／G期至s期的进程，抑制了细胞的增殖，真正的机制还有待于进一步的探讨。