筛选与KDR有结合活性的小肽

目的:从噬菌体12肽库和环7肽库中,筛选能够与KDR分子有特异结合活性的小肽.方法:以KDR/IgGFc为靶分子筛选噬菌体12和环7肽库,经过3轮筛选和竞争性洗脱后,由ELISA、细胞-ELISA和竞争结合实验,鉴定阳性噬菌体克隆并测序.结果:从40个噬菌体克隆中得到12个能特异性与靶分子结合的阳性克隆,其中,6个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合力,6个结合力较弱.结论:测序结果表明,12条小肽的一级结构中没有发现共同模式.特异性与KDR结合的活性小肽,有望在临床上作为放化疗药物的导向肽,以提高药物的选择性和降低其毒副作用.

肿瘤坏死因子α和干扰素α逆转K562/A02耐药性的研究

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素α(IFN-α)对耐阿霉素(ADR)K562细胞株耐药性的逆转作用.方法:应用MTT法,分析TNF-α和IFN-α(均为100 U/m1)分别处理K562/A02前后,K562/A02对ADR敏感性的变化.采用半定量RT-PCR和免疫组织化学染色法,观察mdr1基因的表达;应用流式细胞技术检测细胞内ADR浓度的变化.结果:TNF-α与IFN-α分别处理K562/A02细胞,24 h后逆转倍数为6和5,处理48 h后,逆转倍数分别为10倍和8倍,均具有显著差别;但72 h后,逆转倍数反而减小.在TNF-α和IFN-α孵育后2 h,K562/A02细胞内ADR的积累分别增加2.2和1.8倍,而对K562/S无明显增加ADR积累作用.结论:TNF-α和IFN-α(100U/m1)对K562/A02的耐药性具有明显的逆转活性,其作用似乎呈时间依赖性.由于低剂量TNF-α和IFN-α毒性微小,因此,具有一定的实际临床应用意义.

人黏连蛋白基因在肝细胞癌中表达的研究

肿瘤的发生是多步骤、多因素、多阶段参与的病理过程,与肿瘤细胞的增殖、凋亡、黏附、瘤体内外血管形成等因素有关.人黏连蛋白(fibronectin FN)的主要生物学作用是促进细胞与细胞外基质的黏连及异源细胞间的相互黏附.近年研究发现FN在脑胶质瘤、胃癌和肾癌中表达异常增高[1-2].本实验结合cDNA基因芯片和原位杂交方法,检测了肝细胞癌组织中人FN基因的表达水平,初步探讨该基因在肝细胞癌发生机制中的作用,为进一步实施肝癌的生物学治疗打下基础.1材料与方法1.1临床标本10例肝细胞癌标本取自2000.1～2001.1长海医院普外科患者的手术标本(表1),均为男性,3例正常组织取自捐献遗体,组织标本手术切除后立即分离出肿瘤组织,迅速液氮冻存备用.

IL-4对人肝癌细胞侵袭力及转移力的调节作用

目的:研究IL-4对肝癌细胞侵袭力及转移力相关因素的调节作用.方法:用IL-4处理肝癌细胞,采用流式细胞仪分析肝癌细胞表面抗原分子的表达水平,用附壁试验检测肝癌细胞对细胞外基质的亲和力,用细胞聚集试验检测肝癌细胞的聚集能力以研究IL-4对肝癌细胞侵袭力及转移力相关因素的调节作用.结果:经高浓度和低浓度IL-4处理后,肝癌细胞表面ICAM-1及HLA-I类抗原表达均增加,CD44表达减少,肝癌细胞对细胞外基质的亲和力及肝癌细胞聚集程度均降低.结论:IL-4可明显增加肝癌细胞ICAM-1及HLA-I类抗原的表达,抑制CD44表达,抑制肝癌细胞对细胞外基质的亲和力及聚集作用.因此可抑制肝癌细胞的侵袭力和转移力.

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子活性测定标准品的研制

目的:建立效价测定用的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)国家标准品.方法:标准品按WHO有关要求进行制备、分装、冻干、检测,用GM-CSF国际标准品为标准进行协作标定.结果:冻干重组GM-CSF标准品经检测外观,无菌实验合格,水分为0.93%,加速热稳定实验表明其生物学活性在温度为-20℃,4℃和25℃,37℃条件下23个月保持稳定.该标准品经3家实验室协作标定共21次测定,几何平均效价为1.77×105 IU/支.实验均数的95%可信区间为(1.64～1.90)×105IU/支,单次实验的95%参考值范围为(1.23～2.34)×105 IU/支,平均可信限率为6.962%.结论:该批重组GM-CSF国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,效价定为1.8×105 IU/支,编号为98/01.

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的:探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体.方法:以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白(MUC1/Yex)为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氨基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆与正常及肿瘤细胞的结合能力及特异性.结果:通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MUC1/Yex的结合中起重要作用.阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合.结论:筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究.

HSV-tk基因在人乳腺癌细胞中的表达及其诱导杀伤的特性研究

HSV-tk基因转移联合GCV的方法已成为肿瘤基因治疗的重要策略之一[1].HSV/TK-GCV系统通过直接作用或旁观者效应杀伤肿瘤细胞,被杀死的瘤细胞经抗原递呈细胞如DC处理后,递呈给T细胞,从而产生了肿瘤特异性免疫.自杀基因疗法在治疗肿瘤时,瘤细胞的接种作用和凋亡现象均能刺激机体免疫系统,通过免疫反应可能达到消灭肿瘤、保护宿主以防肿瘤复发和转移的长期作用[2].本研究利用逆转录病毒将Hy-tk基因转入人乳腺癌细胞株MCF-7中,经潮霉素筛选获得了稳定表达tk的MCF-7/TK细胞克隆,在GCV作用下,其细胞生长受到抑制并与GCV浓度呈正相关性.在MCF-7/TK-GCV系统中存在辐射敏感性;FACS和电镜显示,MCF-7/TK-GCV系统的细胞杀伤中存在凋亡现象.

特异性核酶诱导宫颈癌细胞凋亡的研究

目的:研究特异性抗HPV16E6核酶对宫颈癌细胞凋亡的影响.方法:设计特异性切割HPV16E6基因的核酶,构建抗HPV16E6核酶的真核表达质粒.以脂质体法将抗HPV16E6核酶、空载体质粒分别导入CaSKi细胞,命名为CaSKi-R,CaSKi-P细胞.Northern杂交检测3种细胞中E6基因的表达.流式细胞仪检测3种细胞的凋亡率,并测定HPV16E6,c-myc,bcl-2,p53,fas等蛋白的表达.将3种细胞在相差显微镜和荧光显微镜下观察,采用荧光(Hoechst33342)染色和TUNEL(TDT-mediated dUTP nick endlabelling)2种方法测定细胞凋亡.结果:Northern杂交证实CaSKi-R中表达E6较CaSKi-P,CaSKi明显降低.与CaSKi细胞相比,CaSKi-R细胞形态发生改变,凋亡率明显增高,出现凋亡峰,S期、G2M期细胞百分率下降,而CaSKi-P细胞无此改变.CaSKi-R细胞表达HPV16E6,c-myc,bcl-2蛋白明显减少,而表达p53明显增高;两者中fas蛋白的表达相近.CaSKi-P细胞中各基因的表达与CaSKi细胞无显著差异.结论:抗HPV16E6-Ribozyme的导入能诱导宫颈癌细胞凋亡,其原因可能在于病毒癌基因E6表达的降低,以及由此而引起的细胞内一系列基因表达的改变.

恶性实体瘤患者自体CIK细胞的体外大量扩增与生物学指标检测

CIK细胞(cytokine-induced killer)是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞[1].与LAK和TIL细胞相比,其具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤敏感、不受免疫抑制剂的影响、对正常骨髓造血毒性小[2]等优势.目前常用的CIK细胞主要来自异体正常供者或白血病患者的外周血[3],对于实体瘤患者自体外周血来源CIK细胞,尤其是不同临床阶段患者自体CIK细胞体外增殖和杀瘤特点以及体内治疗作用未见任何报道.本文比较了我院2000.11～2001.4半年内行CIK治疗的10例术后和晚期实体瘤患者的自体CIK细胞表型及细胞毒活性,以期为恶性实体瘤患者开展CIK细胞治疗提供更完整的临床前期实验依据.

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的:研究肿瘤化疗后转染pCH510质粒是否提高疗效,以及二者衔接是否需要特定的条件.方法:采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型;通过基因转染,观察pCH510对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH510转染的抑瘤效果;采用细胞培养技术,观察小鼠体内注射化疗药物后,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响;采用细胞计数的方法,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH510转染,观察抑瘤效果.结果:转染pCH510对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用,并呈负相关.化疗药物可使免疫细胞代谢降低,活化受阻,在化疗后第3天免疫细胞数降至低,约10 d左右恢复正常;化疗后立即连续10 d转染pCH510质粒,疗效没有增强;化疗5 d后,再连续15 d转染pCH510质粒,则疗效明显增强.结论:化疗后转染pCH510质粒,对小鼠肿瘤治疗效果更好,但由于化疗既降低免疫细胞数量,又抑制其功能,化疗后立即转染pCH510质粒是不恰当的,并且转染治疗时间不宜过短.pCH510、化疗和化疗+pCH510三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性,既抑瘤又促瘤.

VEGF受体KDR克隆及其对内皮细胞增殖和血管新生的影响

目的:克隆VEGF受体KDR基因膜外5-7区,探讨其生物学活性.方法:提取脐静脉血管内皮细胞总RNA,克隆KDR基因膜外部分5-7区,并使之在QIA表达系统进行表达;镍柱亲和层析纯化、复性、生物学活性鉴定.结果:该系统能表达KDR基因片段,表达量约占菌体蛋白总量的5%左右.经复性,可溶性蛋白具有与VEGF特异结合功能,并能抑制VEGF促使脐静脉内皮细胞增殖和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的作用.结论:KDR基因片段能在QIA表达系统中得到表达,复性后表达蛋白具有与VEGF结合的生物学功能.

凋亡素诱导人成骨肉瘤细胞多药耐药株凋亡的研究

目的:研究凋亡素对人成骨肉瘤细胞0S-732多药耐药株R-OS-732的作用.方法:凋亡素基因VP3经酶切后克隆入质粒pIRES1,获得重组质粒pIRVP3,通过脂质体法pIRVP3转染R-0S-732细胞,RT-PCR检测凋亡素在细胞中的表达;光镜及电镜下观察瘤细胞;提取瘤细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳;流式细胞仪检测凋亡率.结果:凋亡素基因已在转录水平表达;光镜及电镜下两组细胞形态变化明显;电泳见转染组DNA呈梯状条带,对照组为单一条带;转染组凋亡率明显高于空白对照组(P＜0.01).结论:凋亡素可有效诱导R-OS-732细胞凋亡.

干扰素对KBv200细胞多药耐药性逆转的研究

目的:探讨不同浓度的干扰素(IFN-α)对人口腔表皮癌细胞株KB及多药耐药细胞株KBv200的影响.方法:以MTT法测定梯度浓度的干扰素及长春新碱(VCR)的细胞毒性变化.以流式细胞仪测定IFN-α作用后肿瘤细胞对罗丹明蓄积作用的变化及P-膜糖蛋白(PgP)的变化.用RT-PCR法检测多药耐药基因(mdr-1)mRNA.结果:高浓度IFN-α(10 000 IU/ml)能明显抑制KB/KBv200细胞的增殖作用.低浓度IFN-α(1 000 IU/m1)能增强VCR对耐药细胞KBv200的杀伤作用,增加KBv200细胞对罗丹明的蓄积,下调PgP和mdr-1 mRNA表达,对敏感细胞KB无作用.结论:IFN-α对KBv200细胞的多药耐药性有明显的逆转作用,且在一定浓度范围内有剂量依赖性,其机制是通过下调Pgp和mdr-1 mRNA表达逆转多药耐药性.

无血清培养基与完全培养基对体外诱导免疫细胞支持作用的比较

目的:多方面比较无血清培养基AIMV与完全培养基对体外诱导免疫细胞支持作用.方法:分别用AIMV及完全培养基在IFN-γ,IL-2,及抗-CD3单抗存在的条件下培养人外周血单个核细胞,比较细胞的增殖能力、细胞表型、及细胞因子分泌能力,并比较不同培养基培养细胞回输体内后的抑制病毒效果.结果:与完全培养基培养细胞相比,无血清培养基AIMV培养细胞增殖能力与之相当;CD25的表达率增高,表达持续时间延长;细胞因子IFN-γ的分泌时间延长;回输体内后的抑制病毒作用更明显.结论:无血清培养基AIMV用于培养临床治疗用的免疫细胞,综合效果优于完全培养基.

缝隙连接与自杀基因旁观者效应研究进展

在自杀基因治疗中,旁观者效应表现为转染细胞对临近未转染细胞的毒性作用,是决定自杀基因疗效的关键因素.研究证实,细胞缝隙连接(gap-junctions,GJs)是旁观者效应的主要机制;检测这种连接的基本组成元件一接合素,可供筛选肿瘤细胞对自杀基因的敏感性;通过生化或基因转移的方法诱导细胞GJs,可增强GJs功能缺陷细胞自杀基因的旁观者效应.

NF-κB活化与肿瘤细胞对治疗的敏感性

不同类型的肿瘤细胞对化学药物、放射治疗、TNF-α治疗都表现出不同的敏感性.NF-κB作为Rel家族的一个成员,能够被电离辐射、细胞因子和化学因子激活.NF-κB活化后启动转录合成一些细胞因子和保护蛋白,能对细胞提供有益保护,增加其应激耐受性.在肿瘤治疗中,NF-κB活化影响肿瘤细胞对治疗的敏感性.通过抑制NF-κ活化,可提高放疗、化疗和TNF-α治疗肿瘤的疗效,用作肿瘤治疗的有效辅助手段.

TRAIL/TRAILR系统与凋亡

TRAIL是近年来发现的凋亡分子之一,其显著的特征就是能够选择性的诱导肿瘤细胞或转化细胞的凋亡,而对正常组织没有明显的毒性作用.目前发现TRAIL分子在体内有4个膜结合型受体,和一个分泌型受体.这些受体在体内不同组织的选择性表达参与调控不同组织对TRAIL诱导凋亡的敏感性.因此,本文从TRAIL和TRAILR的发现、分子结构、表达调控、和诱导凋亡的分子机制4个方面详细介绍了TRAIL与凋亡的关系.

热休克蛋白gp96抗肿瘤免疫的研究进展

热休克蛋白(HSP)gp96是一种高度保守和呈单态性的蛋白质.它具有分子伴侣功能,能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影响.gp96-肽复合物也可在体外形成,并具有与体内相似的免疫活性.gp96参与MHC I类抗原的提呈.用肿瘤源gp96-肽复合物免疫小鼠可诱发抗相应肿瘤细胞的MHC I类限制性CD8+细胞毒性T细胞免疫应答,并能产生记忆性T细胞应答,具备了作为疫苗的一个关键要素,为肿瘤免疫治疗开辟了一个新的途径.

基因工程双特异性抗体构建模式及其在肿瘤诊治中的应用

双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一,现已成为抗体工程研究领域的热点.随着分子生物学技术的迅速发展,出现了基因工程双特异性抗体的多种构建模式,并且有多种基因工程双特异性抗体制剂已经用于肿瘤的临床诊断和治疗试验.本文仅就这两方面的研究进展进行综述.

结直肠癌浸润和转移分子机制研究进展

结直肠癌浸润、转移常影响临床治疗效果,也是患者死亡的主要原因.浸润、转移涉及一系列多机制、多步骤的复杂过程,如原发肿瘤组织中具有转移潜能的细胞亚群的异常增生、黏附分子介导癌细胞间或癌细胞与细胞基质间的黏附与脱黏附、水解酶对细胞外基质的降解、癌细胞的迁移运动、新生血管的形成、癌细胞逃逸机体免疫系统的攻击等.针对癌细胞浸润、转移的各步骤,从分子水平进行阻断治疗,将会大大提高结直肠癌现有治疗效果,提高患者的生存率.

肿瘤引起T细胞和NK细胞的ζ链水平下调或缺失

ζ(zeta)链是一种跨膜信号蛋白,以二聚体形式表达在T和NK细胞膜上,影响T和NK细胞的活化.在肿瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和外周血淋巴细胞(PBL)中,T和NK细胞ζ链的水平往往比正常人低甚至缺失,从而导致T和NK细胞丧失免疫活性.ζ链水平低下的患者,其存活率常低于ζ链正常的患者而且预后不好.在免疫细胞内,肿瘤诱导活化的caspase能引起ζ链在蛋白水平的降解,而患者体内的巨噬细胞通过产生H202也能降低ζ链的水平,但可被过氧化氢酶抑制.深入研究肿瘤患者ζ链下调机制,对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义.

以肿瘤血管为靶标的癌症治疗研究

异常活跃的血管发育是恶性肿瘤生长的一个重要条件.肿瘤血管有3个要素使它成为开发抗癌药物的一个较好的靶标.第一,同基本处于静止状态的正常血管相比,肿瘤血管内皮细胞处于高度生长状态,因此成为突出目标.第二,肿瘤血管细胞是从正常组织进入肿瘤的正常细胞,基因组稳定,不象基因组极不稳定的癌细胞那样容易产生多种抗药性,因此可能较易控制.第三,尽管各种肿瘤细胞差异极大,其血管细胞因为是正常细胞,差异较小,因此同一药物如果针对肿瘤血管则可能对不同肿瘤均有疗效.本文对目前国际上对肿瘤血管发育机理的了解,常用的研究手段,及抗血管生长药物开发等方面的概况作一简介.

《胰腺病学》杂志于今年创刊