改良鱼精蛋白-脂质体-寡聚核苷酸复合体法转染卵巢癌SKOV3细胞

目的:优化鱼精蛋白-脂质体-寡聚核苷酸(oligodeoxynuleotides,ODN)复合体(1iposome-protamine-ODN,LPD)法以提高SKOV3细胞的转染效率,并探讨该转染法对细胞体外增殖能力的影响.方法:参照文献设计核转录因子-κB(NF-κB)诱捕物ODN和对照物Scrambled ODN,并用FITC标记.LPD表面+/-电荷比例设计为1,2,4,6,并按转染液中是否含有小牛血清分成2组.用荧光光度计、流式细胞仪测定转染效率.用MTT法观察LPD法对SKOV3细胞在体外增殖的影响.结果:SKOV3细胞经LPD法转染,+/-电荷比例为4时转染效率高,达96.41%,而无鱼精蛋白-脂质体的裸露ODN细胞转染效率为12.87%,两者差异有统计学上的高度显著性意义.培养液中10%小牛血清对转染效率无明显影响.结论:适宜电荷比例的LPD法是一种不受血清影响的高效率转染方法,有望用于体内转染.

不同途径免疫的AFP基因修饰DC瘤苗体内抗肿瘤效应的研究

目的:探讨腺病毒介导AFP基因修饰的DC(AFP-DC)瘤苗经不同途径免疫后机体抗肿瘤免疫应答反应.方法:采用皮下注射、静脉注射和瘤体注射三种途径回输AFP-DC瘤苗,比较观察AFP-DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用,应用4h51cr释放杀伤实验、T细胞与NK体内剔除实验等方法,观察AFP-DC瘤苗对荷瘤小鼠免疫治疗作用及保护性免疫反应.结果:皮下注射AFP-DC瘤苗治疗效果在抑制肿瘤生长、延长小鼠存活期方面都明显优于瘤体内注射或尾静脉注射(P＜0.05),AFP-DC瘤苗体内能更有效地诱导特异CTL细胞毒活性,能使免疫动物产生一定的免疫保护作用,抵抗肿瘤细胞的再攻击.在AFP-DC瘤苗诱导抗肿瘤免疫排斥反应过程中,必需有CD4+T和CD8+T细胞的参与;而在其效应阶段,则依赖于CD8+T细胞的参与,CD4+T细胞为非必需;在免疫诱导及效应阶段剔除NK细胞对抗肿瘤免疫应答无明显影响.结论:皮下注射AFP-DC瘤苗能有效诱导机体产生抗肿瘤免疫反应,为DC介导的肝癌免疫治疗开辟了新的途径.

肿瘤抗原致敏树突状细胞协同CD3AK细胞的抗肿瘤作用

树突状细胞(dendritic cells,DC)作为体内的专职抗原提呈细胞,具有强大的激发初次免疫应答的独特功能,在肿瘤免疫治疗中已显示出其重要的应用价值[1-2].CD3AK细胞(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells,CD3AK),具有高效而广谱的抗肿瘤作用[3].本实验旨在探讨DC与CD3AK细胞联合应用能否产生协同抗肿瘤作用,为肿瘤临床治疗提供新的思路.

人血管生成素-1对血管内皮细胞增殖及凋亡影响的研究

目的:探讨人血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)对人脐静脉内皮细胞(human umbilican vein endothelia cell,HUVEC)增殖和凋亡的影响,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制.方法:构建pcDNA3.1-V5-HisC-Ang-1真核表达载体,并瞬时转染293细胞;取新生儿脐带经胶原酶消化等方法分离培养HUVEC;分别通过MTT比色和细胞计数法,分析Ang-1瞬时转染上清对HUVEC增殖的影响;通过流式细胞仪分析在血浆饥饿实验条件下,Ang-1对HUVEC凋亡的影响.结果:成功克隆了Ang-1基因,构建了其正义真核表达载体,并在293细胞中瞬时表达;成功进行了HUVEC的原代分离及传代培养;MTT法检测HUVEC增殖结果:只加培养液组、加空载体转染上清组、加Ang-1转染上清组HUVEC OD490值分别为0.36±0.11,0.40±0.03,0.68±0.10(P＜0.05);细胞计数法检测结果依次为:(10.13±2.06)×104,(8.7±1.73)×104,(15.03±1.98)×104(P＜0.05).流式细胞仪检测HUVEC凋亡率依次为:21%,19%和6%.结论:Ang-1能显著促进血管内皮细胞体外增殖,抑制血浆饥饿时HUVEC的凋亡.

雷公藤内酯醇对人宫颈癌细胞的凋亡诱导效应

目的:观察雷公藤内酯醇是否能抑制肿瘤细胞增殖,并探讨其是否通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用.方法:选择人宫颈癌细胞株HeLa为研究对象,以MTr实验检测肿瘤细胞的增殖,以AnnexinV/PI染色检测细胞的凋亡,R123染色检测线粒体膜电势的变化.Hoechst 33258荧光染色法观察细胞形态学改变,琼脂糖凝胶电泳检测染色体DNA断裂.结果:雷公藤内酯醇能明显抑制HeLa细胞的增殖;AnnexinV/PI染色结果证明雷公藤内酯醇能诱导HeLa细胞凋亡,R123染色结果说明雷公藤内酯醇诱导的细胞凋亡与线粒体膜电势的变化有关.雷公藤内酯醇处理的HeLa细胞可见凋亡特有的形态学及生物化学改变,DNA电泳呈梯状条带.结论:雷公藤内酯醇可以通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用.

TRAIL基因原核表达载体的构建、表达与抗体制备

目的:获取抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗体.方法:利用PCR技术和基因重组技术将TRAIL基因构建于原核表达载体pPreTMH-Tb中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌DH-5α中获得表达,并将TRAIL蛋白免疫家兔,通过Dot blot及Western blot检测抗TRAIL抗体的产生.结果:成功构建TRAIL基因原核表达载体,并在大肠杆菌DH-5α中获得表达,TRAIL蛋白表达量占菌体蛋白质总量的11.8%,Dot blot及Western blot检测证实获得了抗TRAIL抗体.结论:成功制备抗TRAIL抗体,这为TRAIL在真核细胞水平研究奠定了实验基础.

罗勒多糖对肿瘤转移行为的影响

目的:观察罗勒多糖对肿瘤细胞不同途径转移行为的影响,并从细胞间通讯功能的恢复以及体内NK细胞活性的变化两方面探讨其抗肿瘤转移的可能作用机制.方法:Metfigel穿膜法体外观察罗勒多糖对肿瘤细胞移动活性的影响;建立不同途径的肿瘤转移模型,体内观察罗勒多糖对肿瘤转移行为的影响.SLDT技术检测罗勒多糖对细胞通讯功能的影响;51Cr释放法检测罗勒多糖对NK细胞活性的影响.结果:罗勒多糖在体内外均具有显著的抗肿瘤转移作用;与对照组相比细胞间通讯功能有一定程度的恢复;NK细胞的活性明显提高.结论:罗勒多糖具有明显的抗肿瘤转移作用,可能是一种具有潜在开发价值的新的抗肿瘤转移药物,其抗肿瘤转移作用是通过多个药效靶点综合作用的结果.

bcl-2反义寡核苷酸对肾癌细胞Bcl-2蛋白表达抑制及诱导凋亡作用

目的:评价bcl-2反义寡核苷酸对肾细胞癌细胞Bcl-2蛋白表达抑制及诱导凋亡作用.方法:合成与已知人类基因无同源性的bcl-2反义寡核苷酸(AS1与翻译起始端互补,AS2与编码区互补),以阳离子脂质体Lipofectin为转染载体,MTS比色实验测定细胞活率,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定bcl-2 mRNA的表达,Western杂交法测定Bcl-2蛋白表达,碘化丙啶(PI)染色流式细胞术测定凋亡细胞.结果:所测定的5个肾癌细胞株均有稳定的bcl-2 mRNA表达;转染的反义寡核苷酸对ACHN细胞Bcl-2蛋白的表达有明显抑制作用,而正义寡核苷酸无明显影响,AS2的抑制作用大于AS1;反义寡核苷酸可诱导ACHN细胞的凋亡,AS1和AS2的诱导率分别为32.1%和43.2%.结论:bcl-2反义寡核苷酸可抑制肾癌细胞Bcl-2蛋白的表达,并进而诱导细胞的调亡.

锚定表达GM-CSF疫苗的抑瘤效果研究

目的:研究锚定表达GM-CSF的小鼠黑色素瘤作为肿瘤疫苗的有效性.方法:GM-CSF基因嵌合GPI信号肽修饰序列实现在B16小鼠黑色素瘤细胞表面的锚定表达,研究锚定修饰的B16细胞于同源C57BL/6小鼠的成瘤性及诱导抗肿瘤免疫的效果.结果:抑瘤实验结果表明,锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞免疫原性增强,成瘤性明显下降;成瘤率为58.8%,而肿瘤对照组为100%.活瘤苗接种实验结果显示锚定修饰的肿瘤细胞可以预防肿瘤的发生,肿瘤发生率仅为20%,说明抗肿瘤的免疫应答有记忆性,能够有效地防止野生型肿瘤细胞的攻击.结论:锚定修饰GM-CSF的肿瘤细胞可以诱导抗特异性的抗肿瘤反应,这种设计可以应用于肿瘤疫苗的研究中.

抗膀胱癌免疫毒素BDI-1-PEA特异杀伤肿瘤细胞的研究

目的:探讨免疫毒素BDI-1-PEA特异杀伤膀胱癌细胞的体外及体内研究.方法:应用MTT法检测不同浓度的BDI-1-PEA,BDI-1和PEA的混合物(BDI-1+PEA),PEA对体外癌细胞的杀伤能力.接种于裸鼠背部皮下的癌细胞长至0.3cm大小实体瘤时,于尾静脉隔日分别注入BDI-1-PEA、BDI-I、正常小鼠IgG共6次,观察不同的药物对癌的抑制作用.结果:免疫毒素BDI-1-PEA在体外抗膀胱癌细胞系E-J的作用明显优于PEA及BDI-1与PEA的混合物,在荷瘤裸鼠体内明显优于BDI-1及IgG,与对非靶细胞的细胞毒性作用相比较差异非常显著.结论:免疫毒素BDI-1-PEA是一种很有潜力的抗癌药物,为进一步临床研究奠定基础.

携带TIP30与人IFN-γ基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏茵的构建及抗腺样囊性癌的初步研究

目的:构建含有TIP30与人IFN-γ基因的真核共表达质粒的减毒伤寒沙门氏菌,观察以减毒伤寒沙门氏菌为载体的,联合TTP30与IFN-γ的基因治疗对腺样囊性癌的疗效.方法:PCR扩增TIP30和人IFN-γ基因,分别插入真核表达载体pCI-neo,构建成重组表达质粒pCI-TIP30、pCI-IFN和TIP30、IFN-γ基因共表达质粒pCI-TIP30/IFN.分别将重组表达质粒转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,体外感染小鼠巨噬细胞株,用免疫印迹和ELISA对表达产物进行鉴定,将重组菌口服给腺样囊性癌荷瘤裸鼠,观察其疗效.结果:免疫印迹试验表明质粒pCI-TIP30和pCI-TIP30/IFN转化菌感染的小鼠巨噬细胞能表达TIP30蛋白,ELISA检测则显示pCI-IFN和pCI-TIP30/IFN转化菌感染的小鼠巨噬细胞能分泌性表达人IFN-y,减毒沙门氏菌本身和3种表达质粒转化的重组沙门氏菌对腺样囊性癌均有治疗作用,且TIP30与IFN-γ具有明显的协同作用.结论:成功构建了分别携有真核表达质粒pCI-TIP30、pCI-IFN、pCI-TIP30/IFN的减毒鼠伤寒沙门氏菌,对腺样囊性癌荷瘤裸鼠有显著的治疗作用.

经犬肝动/静脉输入反义c-myc重组腺病毒的安全性研究

目的:经Beagle犬肝脏血管注射重组腺病毒介导反义c-myc基因(Ad-ASmyc)载体,观测其体内分布及毒副作用,以评价Ad-ASmyc治疗肝癌的临床前期安全性.方法:选择4只体重8～10kg健康Beagle犬,全麻后开腹,经肝动脉或门静脉注射Ad-ASmyc,注射Ad-ASmyc前及注射后第3,7,14,21天取肝组织及抽取静脉血化验,PCR检测Ad-ASmyc在各器官组织中的分布,常规切片观察各器官病理变化,ELISA方法检测血中抗腺病毒抗体的产生.结果:经Beagle犬肝脏血管注射后,Ad-ASmyc可持续转导正常肝细胞达3周,实验犬一般情况好,血、肝、肾功能无明显异常,在肝脏、脾脏、肾脏、胃、心脏、皮肤中可检测到重组腺病毒的分布,镜下可见Ad-ASmyc剂量依赖性的肝组织轻微的炎症反应,注射后7d血中有抗腺病毒载体的抗体产生,14d达高峰,21d开始下降.结论:经Beagle犬肝动脉或门静脉途径注射Ad-ASmyc均可转导至肝细胞,Ad-ASmyc对实验犬的毒副作用较轻.

腺病毒介导的小鼠内皮抑素治疗胃癌的研究

目的:研究腺病毒介导的鼠内皮抑素基因对胃癌的治疗作用.方法:利用病毒重组技术将内皮抑素克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中,观察体外转染表达后的生物学活性.通过建立荷人胃癌的裸鼠动物模型,分析基因转导后动物肿瘤细胞中内皮抑素的表达情况及对肿瘤的抑制作用.结果:构建了表达内皮抑素的重组腺病毒载体pCA13-mEndo;检测到内皮抑素在体外的mRNA水平和蛋白质水平均有表达;鸡胚绒毛尿囊膜实验表明其对血管生长起抑制作用;荷瘤裸鼠体内肿瘤生长抑制明显.结论:所构建的pCA13-mEndo重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的内皮抑素,使得肿瘤内微血管生成减少,肿瘤细胞增殖减慢,为抗血管生成方法治疗实体瘤的临床应用奠定基础.

白血病细胞来源的树突状细胞在治疗白血病中的应用

树突状细胞(DC)广泛分布于体内,是机体功能强的抗原递呈细胞(APC),在免疫应答中起着桥梁作用.近有文献报道,白血病细胞经诱导后能分化为DC,从而启动特异性的机体抗白血病免疫应答,使白血病的治疗取得了可喜进展.将白血病细胞诱导成为具有递呈肿瘤抗原特性的DC,激发自体特异性细胞毒性T淋巴细胞的产生,对白血病细胞产生杀伤作用,表明白血病细胞来源的DC的诱导方案,其细胞生物学特性及白血病的治疗具有广泛的应用前景.

人参皂苷抗肿瘤作用的研究进展

人参皂苷作为名贵药材,历史悠久,目前国内外对其活性进行了深入研究,本文主要对在抗肿瘤方面的任用及其机理进行详细介绍,包括:促进肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化,增强化疗药物的敏感性,抑制肿瘤血管形成,提高机体抗肿瘤免疫力以及拮抗肿瘤细胞黏附,相信随着对人参苷的药理作用的深刻认识,人参皂苷在将来临床应用和预防治疗肿瘤方面具有潜在的应用前景.

RNA类药物在疾病治疗中的研究进展

RNA类小分子可作为治疗性药物应用于各类疾病的治疗.这类小分子主要包括基因表达抑制剂、基因修复剂、蛋白拮抗剂及RNA疫苗,目前已有多种反义RNA和核酶作为基因表达抑制剂正在进行各期临床试验,它们主要用于心血管疾病、肿瘤、药物代谢性疾病、病毒性肝炎和艾滋病等疾病的治疗.蛋白拮抗剂aptamers已作为治疗老年性黄斑和血栓药物进入临床Ⅱ,Ⅲ期试验.RNA疫苗作为免疫调节剂治疗前列腺癌和肾癌的临床试验也在进行中.

肿瘤干细胞研究进展

肿瘤研究的基本问题之一是哪些肿瘤细胞能够无限生长.传统理论认为肿瘤生长是所有肿瘤细胞一起增殖的结果.近通过对造血系肿瘤的研究发现肿瘤细胞的生长繁殖和干细胞之间有许多惊人的相似之处,提出了肿瘤干细胞学说,认为肿瘤生长是肿瘤组织中极少量具有特殊细胞表面标志的肿瘤干细胞增殖的结果.研究证明人类急性髓性白血病(AML)中的肿瘤干细胞存在于CD34+/CD38亚群中,而人乳腺癌中的肿瘤干细胞属于ESA+CD44+CD24-/low亚群.肿瘤干细胞概念的提出,提供了靶向性或选择性杀伤肿瘤干细胞从而根治肿瘤和防止肿瘤复发和转移的可能性.研究肿瘤干细胞特异性的生物学特点,对肿瘤的发生、发展和转归的理论以及肿瘤的诊断、预防和治疗均有重要意义.

美罗华和Zevalin治疗非霍奇金淋巴瘤临床研究

美罗华单克隆抗体具有高度特异性,毒副作用小,是近年来淋巴瘤治疗上的突破性进展.临床可用于各种B细胞NHL的一线或二线治疗,可单独应用,亦可与化疗药物联合应用以提高疗效.Zevalin为90Y标记的鼠抗CD20单抗,于2002年通过FDA批准.可用于治疗美罗华治疗无效或复发的NHL患者,有效率仍可高达54%.

红细胞在抗肿瘤治疗中的作用

红细胞不仅可以运送氧、二氧化碳和清除循环免疫复合物,还能够识别、黏附、提呈肿瘤抗原,此外红细胞能够促进免疫细胞吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力,因此红细胞在机体抗肿瘤免疫发挥重要作用.近年来,红细胞也可以开发作为药物载体治疗肿瘤,这与红细胞自身具有生物相容性和半透膜的特性有关.药物可以倍助渗透压梯度的不同、抗生素提高膜通透性,膜受体介导连接,以及交联介导连接等方法载入.已载入红细胞的药物半衰期延长,缓慢释放,受体液中酶等具有生物活性的物质降解,并且可以减轻药物毒副作用.缺点在于其靶向性单一.

腺相关病毒及其在肿瘤基因治疗中的研究进展

重组腺相关病毒是一种用于基因治疗的安全而有效的病毒载体,近年来在其基础及应用方面的研究均取得了较大的进展,已成为肿瘤治疗领域中很有希望的方法,目前已用于抗肿瘤免疫基因治疗、抗肿瘤血管新生治疗、分子化疗等方面.腺相关病毒自身具有抗肿瘤活性,重组AAV作为基因治疗载体联合放疗、化疗可起到协同的抑制肿瘤作用相比,重组腺病毒载体在肿瘤基因治疗中有着很大的优势.

表皮生长因子受体抑制剂在肿瘤治疗方面的研究进展

表皮生长因子受体(epidemal growth factor receptor,EGFR)在多种肿瘤细胞中过度表达和/或突变,对肿瘤的发生和发展具有重要影响,因而成为肿瘤治疗的靶向位点之一.目前,靶向EGFR的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)IMC225和酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)ZDl839和OSI-774已进入临床试验阶段,对多种类型的肿瘤显示出了较好的临床疗效.

检测sIL-2R水平探讨老年人肺癌免疫治疗的意义

白细胞介素2(IL-2)具有多种生物学活性,在机体抗肿瘤免疫中起着重要作用.IL-2通过作用于表达白介素-2受体(IL-2R)的细胞而发挥其生物学功能,IL-2R的胞外段脱落形成可溶性白介素-2受体(sIL-2R),二者与肿瘤病情严重程度密切相关.我们采用双抗体夹心ELISA法和免疫组化法,分别对40例老年人肺癌患者的血清及癌组织中sIL-2R的水平进行了检测,以探讨肺癌免疫疗法的可行性.

应用组织芯片检测子宫颈癌组织中抗凋亡基因bag-1的表达

子宫颈癌是妇科比较常见的恶性肿瘤之一,其病因及发病机制不清.近年来,随着细胞分子生物学研究的深入,发现肿瘤的发生发展不仅取决于细胞的增殖速率,而且与细胞凋亡有一定关系,本实验通过对宫颈癌组织芯片进行凋亡相关基因bag-1检测,探讨宫颈癌的发病机制.Bag-1是一种已经被确认的多功能结合蛋白,具有抗细胞凋亡的能力,该蛋白质为一种由219个氨基酸残基组成的酸性蛋白质.

荷瘤小鼠瘤苗治疗疗效与红细胞天然免疫活性相关性及其意义

新近利用抗原处理细胞(APC细胞)处理制备瘤疫效疗较为肯定,认为天然免疫细胞DC细胞瘤疫更有其应用价值.红细胞也是天然免疫细胞.能否用红细胞处理补体调理过的肿瘤细胞制备瘤苗是值得探讨的.有的学者认为红细胞是T细胞活性的调节器,我们的实验有可能为此提供的依据[Arosa FA, Currpharm Des, 2004, 10(27): 191].

多肽致敏的树突状细胞的免疫注射途径控制效应性T细胞与记忆性T细胞在淋巴组织中的分布,并决定局部肿瘤免疫的类型

LPS或全菌体阻断体内炎性单核细胞向树突状细胞(DC)的转化

NKG2家族与肿瘤的免疫逃逸

NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,具有广泛的生物学功能,位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线;不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞,同时又能通过早期分泌多种细胞因子和趋化因子来调节获得性免疫应答,因此,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁[1-2].CTL的识别与杀伤功能具有高度的特异性,即只杀伤表面带有特异性抗原和相应组织相容性复合体的靶细胞,而NK细胞的杀伤不受MHC的限制,在T细胞免疫启动之前,就与Mφ一起构成了细胞免疫系统的第一道防线.