猪血凝性脑脊髓炎病毒HE基因的克隆及原核表达

目的 构建猪血凝性脑脊髓炎病毒株(67N)血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)原核表达系统,为建立特异性免疫学诊断方法提供备选材料.方法 克隆猪血凝性脑脊髓炎病毒(67N)HE蛋白抗原表位富集区基因,构建重组表达质粒pET-HE,并在大肠杆菌中诱导表达.经包涵体的初步纯化,金属螯合层析进一步纯化HE蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测.结果 大肠杆菌可高效表达HE蛋白,目的 蛋白表达量可占菌体总蛋白的42.2%.纯化后蛋白浓度为0.6 mg/ml,纯度为85.4%.所表达的蛋白可被兔抗猪血凝性脑脊髓炎阳性血清所识别.结论 已成功构建猪血凝性脑脊髓炎病毒HE蛋白原核表达载体,重组HE蛋白抗原具有良好的特异性,可作为检测猪血凝性脑脊髓炎病毒血清抗体的候选抗原.

携带人6Ckine/IFNγ融合基因腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建携带人次级淋巴组织趋化因子(6Ckine)和y-干扰素(IFNy)融合基因的重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNy,并在真核细胞中表达.方法 RT-PCR法分别从人淋巴结和外周血单个核细胞中扩增人6Ckine cDNA和IFNT cDNA,分两步先后将6Ckine cDNA和IFN7 cDNA连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,二者之间以Xba I酶切位点相连,应用AdMax腺病毒包装系统在HEK293细胞内同源重组,构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNy,经扩增和纯化后感染真核细胞HepG2,并检测6Ckine/IFNy融合蛋白的表达.结果 所构建的重组腺病毒Ad-6Ckine/IFNy经扩增和纯化后,滴度为1.26×10/10IFU/ml.PCR法鉴定无野生型腺病毒的污染,所携带的6Ckine/IFNy融合基因能在真核细胞中得到表达,表达形式为分泌型.结论 已成功构建重组腺病毒载体Ad-6Ckine/IFNy,并在真核细胞中表达,为进一步研究肿瘤的基因和免疫治疗奠定了基础.

大肠癌相关基因PGDH原核表达质粒的构建及表达

目的 构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白.方法 以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coli DH5a,经温控诱导表达,并经Ni2+ -NTA亲和层析纯化,目的 蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组质粒pBV220-PGDH-Hia6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确.经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量高,约占菌体总蛋白的30%.Western blot验证了表达蛋白的特异性.纯化后目的 蛋白纯度大于95%.结论 已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白.

Neurturin 基因的克隆及其在Vero细胞中的表达

目的 克隆Neurturin(NTN)基因,并在Vero舯细胞中表达.方法 用RT-PCR方法扩增hNTN cDNA,并克隆至pcDNA3真核表达载体中,经Lipofectamine2000转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对转染后细胞的形态及生长状况进行分析.结果 重组质粒 pcDNA3/hNTN转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆,且有目的 蛋白表达,转染后细胞形态和生长特性发生了一定改变.结论 获得了稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,为其移植并进行帕金森病猴基因治疗动物实验奠定了基础.

蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD3的生化性质

目的 研究赤子爱胜蚓组织中1种脱氧核糖核酸酶(EWD3)的主要生化性质.方法 采用Lowry法测定酶的蛋白含量,SDS-PAGE和MALDI-TOF方法测定相对分子质量,毛细管等点聚焦电泳法测定等电点,并测定EWD3酶的酸、碱稳定性、温度稳定性、激动剂和抑制剂对酶活性的影响及酶促反应米氏常数Km值.结果 EWD3酶的蛋白含量为2.1 mg/ml,相对分子质量为63 460,等电点为6.20,Km值为1.52 mg/ml,适pH值为4.4～5.2,不耐高温.Mg2+、Ca2+、Mn2+、10和20 mmnol/L EDTA对EWD3酶活性有抑制作用.这些参数与已发现的各种DNases相比有明显差异.结论 蚯蚓组织中已发现的脱氧核糖核酸酶EWD3具有特殊的酶学特征.

抗菌肽Dermaseptin S4及其突变体基因在大肠杆菌中的表达

目的 构建表达抗菌肽Dermaseptin S4(DS4)及其突变体K4-S4的工程菌,并表达目的 蛋白.方法 采用重叠延伸PCR法设计和扩增抗菌肽DS4及K4-S4基因,定向克隆入载体pUC-18中,经酶切、测序鉴定,重组至表达载体pGEX-4T-1中,构建抗菌肽DS4及K4-S4基因表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE鉴定.结果 构建的抗菌肽DS4及K4-S4基因工程菌所表达的目的 蛋白,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量34 000的特异性目的 条带,37℃诱导5 h的蛋白表达量高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建抗菌肽DS4及K4-S4工程菌,并表达目的 蛋白,为进一步研究其功能和应用奠定了基础.

金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素1基因的检测

目的 检测编码金黄色葡萄球菌中毒休克综合征毒素1(TSST-1)的tst基因,了解该基因的携带情况.方法 用PCR法对产毒素金黄色葡萄球菌染色体上编码TSST-1的tst基因进行体外扩增,并对临床分离的84株金黄色葡萄球菌进行tst基因检测及序列分析.结果 对tst基因进行了检测及测序,84株受检的金黄色葡萄球菌中,tst基因阳性株占19.05%(16/84),测序结果与GenBank公布的金黄色葡萄球菌产TSST-1基因的同源性较高.结论 用PCR法检测tst基因,具有良好的重复性、特异性和敏感性.tst基因阳性株在临床分离的金黄色葡萄球菌中占有较高的比例.

旋毛虫对BALB/c小鼠体内人结肠癌HCT-8细胞的作用

目的 观察旋毛虫感染对BALB/c小鼠体内人结肠癌HCT-8细胞生长的作用.方法 用不同剂量的旋毛虫感染BALB/c小鼠,并在不同时间接种HCT-8细胞,荷瘤20 d后解剖小鼠,测定小鼠体内肿瘤的体积、重量,计算抑瘤率,并检测T淋巴细胞亚群.结果 各实验组小鼠肿瘤体积和重量均显著低于对照组,CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、未长瘤小鼠比例、小鼠死亡率和抑瘤率均显著高于对照组;先接虫后荷瘤组抑瘤效果优于先荷瘤后接虫组.结论 旋毛虫对BALB/c小鼠体内的人结肠癌HCT-8细胞的生长有一定的抑制作用.

HPV16 MuE6/E7嵌合蛋白的原核表达、纯化及其免疫效果

目的 表达HPV16型MuE6/E7嵌合蛋白,并检测其免疫原性及抗肿瘤活性.方法 将构建的重组MuE6/E7蛋白的表达载体转化大肠杆菌BL21(λDE3)进行诱导表达,表达的包涵体蛋白经分离、纯化、变性及复性后,通过离子交换和分子筛层析进行纯化.纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot、HPLC和质谱分析鉴定,并免疫C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性.结果 重组 MuE6/E7蛋白相对分子质量约为21000,表达量约为23.06%,表达形式为包涵体,经复性、纯化后,纯度达97.17%.免疫3针后,小鼠可产生高滴度的HPV特异性抗体,并且与注射剂量呈正相关.免疫小鼠能抵抗,TC-1肿瘤细胞的攻击,并可延长TC-1致瘤小鼠的存活期.结论 已表达并纯化了重组MuE6/E7蛋白,其对TC-1致瘤小鼠具有一定的免疫治疗作用,为进一步研制HPV治疗性疫苗奠定了基础.

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的 在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp)TpN47(68～410 aa)重组蛋白.方法 采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47(202～1230 bp)片段,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47,经酶切鉴定后转化E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,Western blot鉴定其免疫反应性.结果 PCR法扩增出约1 000 bp的目的 片段,原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47经酶切鉴定正确,表达的蛋白约占菌体总蛋白的43%,相对分子质量约为39 000,以包涵体形式存在.经纯化后蛋白纯度达95%以上,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应.结论 所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础.

人乳头瘤病毒疫苗的研究进展

宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二种常见的恶性肿瘤.人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)与宫颈癌的发生密切相关,利用分子生物学方法构建的HPV疫苗对宫颈癌具有预防和治疗作用.目前,HPV疫苗的研究得到了迅速发展,并涌现出许多新的开发策略.本文对HPV疫苗的研究进展和前景作一综述.

化学发光免疫分析技术应用研究进展

本文介绍了化学发光免疫分析技术的基本原理、分类及其在兽医学、医学和食品分析上的应用研究进展.

实时荧光PCR法快速检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株

目的 建立一种敏感、特异、快速的实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒基因YMDD突变株的方法,为临床治疗提供指导.方法 设计引物和TaqMan-MGB探针,利用TaqMan-MGB探针技术,建立实时荧光定量PCR法.检测临床HBV-YMDD变异标本36份和野生型HBV标本20份,并将其YMDD变异结果与DNA测序结果进行比较.结果 该方法检测灵敏度为101拷贝/μl;特异性为100%;低检测限度为101DNA拷贝/30μl反应体系;实时荧光PCR方法测得YMDD野生株20份,变异株36份,与DNA测序结果完全一致,符合率为100%.结论 应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测YMDD变异株基因,具有灵敏、特异和精确等优点,对临床监测拉米夫定耐药具有重要意义.

Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒

目的 利用Vero细胞微载体技术规模化培养轮状病毒.方法 利用5 L生物反应器进行Vero细胞的微载体培养,待细胞密度达1.5×106个/ml时,以0.05 MOI接种轮状病毒P[2]G3株,于37℃连续培养6 d后收获病毒,期间每天取样观察细胞病变(CPE),并检测病毒感染性滴度.结果 在轮状病毒规模化培养的初期,其病毒滴度逐渐升高,至48 h达到高.在上清中,病毒的滴度为5.5CCID50/ml;在细胞裂解产物中,病毒的滴度为3.75CCID50/ml.结论 Vero细胞微载体规模化培养轮状病毒可提高病毒的滴度.

聚乙二醇修饰重组人干扰素-αlb条件的优化

目的 对聚乙醇(PEG)衍生物化学修饰重组人干扰素-αlb(rhIFN-αlb)的条件进行优化.方法 以3种不同的第2代PEG衍生物对rhIFN-αlb进行修饰,SDS-PAGE分析PEG及修饰产物的表观相对分子质量.对反应pH值、温度、时间、修饰剂用量等修饰条件进行优化,并对修饰产物进行初步分离纯化和活性检测.结果 PEG的电泳表观相对分子质量大于其理论值;PEG20000的修饰率(92.1%)高于PEG5000和PEG10000;修饰剂用量和pH值是主要影响因素,佳pH为9.0,rhIFN-αlb与PEC20000的佳摩尔比为1:10,时间和温度影响甚微.单点修饰产物保留了14.4%的体外活性,多点修饰产物无活性.结论 选择了合适的PEG衍生物并优化了修饰条件,为进一步深入研究奠定了基础.

肺炎链球菌补体结合蛋白C3-BP的纯化及其免疫效果

目的 对9V型肺炎链球菌补体结合蛋白C3-BP进行纯化及免疫效果分析.方法 通过三氧醋酸沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等方法,从9V型肺炎链球菌培养上清中提取C3-BP,Lowry法检测其浓度,SDS-PAGE检测其纯度及大小,Westem blot检测其补体C3结合活性.将纯化蛋白免疫NIH小鼠,ELJSA法测定小鼠血清IgG抗体,MTT法测定小鼠脾淋巴细胞增殖情况,活菌攻击,检测其交叉保护效果.结果 经纯化的表面蛋白C3-BP,其相对分子质量约为90 000,为单链蛋白,浓度为0.21 mg/ml,纯度为90.7%,具有与补体C3结合的特性.免疫小鼠后,抗体滴度达到1:38 802.免疫组小鼠脾脏与胸腺淋巴细胞代谢活性明显增强,与对照组相比,二者刺激指数之间差异有显著意义.9V型C3-BP免疫小鼠后,不仅对9V型肺炎链球菌株有保护作用,对2型、6B型和14型肺炎链球菌菌株也有保护作用.结论 摸索出了一种纯化肺炎链球菌表面蛋白C3-BP的方法,纯化的C3-BP具有不依赖血清型的交叉保护作用,而且体液免疫及细胞免疫效果良好.

流感亚单位疫苗裂解剂残留量检测及安全性试验

目的 检测流感亚单位疫苗的裂解剂残留量,并观察其安全性.方法 制备3批流感亚单位疫苗,采用比色法检测其裂解剂Tween-80和CTAB的残留量,通过动物实验观察其安全性.结果 制备的3批疫苗样品,Tween-80的残留量平均在68.3～72.μg/ml之间,CTAB残留量平均在36.3～38.7μg/ml之间.在安全性试验中,豚鼠未出现过敏反应,小鼠和豚鼠未出现异常毒性反应.结论 制备的流感亚单位疫苗的裂解剂残留量符合拟定规程要求,安全性良好.

流感病毒在Vero细胞上的适应性

目的 研究WHO指定流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上的适应性,为用Vero细胞制备流感疫苗奠定基础.方法 优化不同培养基、胰酶浓度、pH值等培养病毒的条件及收毒时间,将流感疫苗生产用毒株在Vem细胞上连续传代,并进行血凝效价检测及RT-PCR分析.结果 在病毒维持液为F12+DMEM、pH为7.5、胰酶含量为1.5μg/ml、培养3 d收获病毒时,可获得较高的病毒血凝效价,连续传4代,病毒血凝效价降为0,RT-PCR检测结果为阴性.结论 WHO推荐的流感疫苗生产用毒株在Vero细胞上连续传代,病毒血凝效价逐渐降低.

抗ICAM-1单克隆抗体的制备及其活性

目的 制备具有生物活性的抗人细胞间黏附分子-1(ICAM-1)单克隆抗体.方法 以人ICAM-1为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术并经HAT选择培养和克隆化,筛选出稳定分泌抗人ICAM-1 McAb的杂交瘤细胞株,并对McAb进行纯化.用ELISA间接法测定效价并鉴定其亚类,Western blot鉴定其抗原特异性,细胞黏附试验检测其中和活性.结果 筛选出1株可稳定分泌抗人ICAM-1抗体的杂交瘤细胞株3F2,杂交瘤染色体众数为98～104.纯化后的单抗蛋白浓度为1.253 mg/ml,纯度达83.6%,效价可达2.56×105.其分泌的抗体亚型为IgGl,腹水效价达5.12×105,可与ICAM-1特异性结合,可抑制ICAM-1与淋巴瘤细胞间的黏附,具有明显的中和ICAM-1的活性.结论 已成功制备出抗ICAM-1的McAb,为其进一步的研究和应用奠定了基础.

骨髓间充质干细胞对豚鼠皮肤光老化的修复作用

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对皮肤光老化的修复作用,为皮肤光老化的治疗提供新途径.方法 每天UV-A和UV-B紫外线灯同时照射2 h,连续照射50 d,制备豚鼠皮肤光老化模型;体外分离培养豚鼠乳鼠MSCs;经DAPI标记后,局部多点皮内注入豚鼠皮肤紫外线照射区域,激光共聚焦显微镜下分别观察注入后24 h、5 d及10 d,DAPI标记的MSCs在紫外线照射区域皮肤组织的迁徙及定居;肉眼及HE染色切片观察MSCs对豚鼠光老化皮肤的修复作用.结果 DAPI标记的MSCs经紫外线照射皮肤区域局部皮内多点注射24 h后,即出现在真皮层,5 d后出现在真皮层及毛囊组织,10 d后广泛弥散在皮肤各层.肉眼及皮肤HE染色切片镜下观察均显示,治疗组豚鼠较模型组明显延缓光老化进程,且在停止照射后,治疗组光老化症状比自然恢复组有更为显著的改善.结论 MSCs对皮肤光老化有明显的延缓及修复作用.

小鼠骨髓间充质干细胞对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用

目的 观察小鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植后,在异基因肝移植模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓中的迁徙、定居情况及对淋巴细胞增殖的抑制作用,以探讨MSCs诱导异基因移植免疫耐受的可能性.方法 体外分离、纯化并培养小鼠MSCs;将小鼠肝组织块埋人大鼠肝脏切口,建立异基因肝移植大鼠模型;经尾静脉移植DAPI标记的小鼠MSCs,通过激光共聚焦显微镜观察24 h及5 d时,MSCs在模型大鼠胸腺、脾脏及骨髓内的迁徙及定居;采用体外淋巴细胞增殖实验检测小鼠MSCs对异基因肝移植大鼠淋巴细胞增殖的抑制作用.结果 MSCs移植后,24 h即散在分布于胸腺、脾脏及骨髓内,5 d时集中在血管周围;经MSC8治疗后,大鼠胸腺和脾脏淋巴细胞增殖均受到抑制,与未经治疗的模型大鼠相比,差异有显著意义.结论 小鼠MSCs可迁徙至异基因肝移植大鼠免疫器官内,并具有抑制淋巴细胞增殖的作用.

血脂康对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的 观察血脂康对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖及胶原合成的影响,并探讨可能的分子机制.方法 采用胰酶消化法分离培养Sprague-Dawley大鼠心肌成纤维细胞,建立AngⅡ诱导CFs增殖的模型,以MTT比色法和流式细胞仪检测细胞周期分析法观察血脂康对CFs数目和细胞周期的影响.AngⅡ及不同浓度血脂康作用48 h后,用天狼星红染色法检测培养上清中胶原的含量;ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1蛋白表达;RT-PCR法检测胶原和TGF-β1 mRNA表达.结果 AngⅡ对CFs增殖有明显促进作用,血脂康可明显抑制AngⅡ诱导的CFs增殖,且呈剂量依赖性;血脂康可增加G0/G1期细胞百分率,降低S、G2/M期细胞百分率,降低胶原含量、TGF-β1蛋白及胶原和TGF-β1 mRNA的表达.结论 血脂康能抑制AngⅡ诱导的CFs增殖和胶原的产生,其作用可能是通过抑制TGF-β1 mRNA表达实现的.

国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果

目的 观察国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗接种反应及免疫效果.方法 对93名观察对象采用0、3、7、14和28 d程序进行暴露后免疫,观察免后30 min的即时反应及72 h内的局部和全身副反应,并于第1针免疫后3、7、14和45 d采血,检测血清抗体水平.结果 疫苗接种后均无异常反应,局部及全身一般反应率分别为5.8%和4.5%.免后7 d,血清抗体阳转率达22.58%,14 d达100%;免后7、14和45 d的GMT差异有显著意义;不同性别间免后14和45 d的GMT差异均无显著意义;不同年龄组间GMT 14 d差异有显著意义,45 d差异无显著意义.结论 国产无佐剂人用Vero细胞狂犬病疫苗安全,免疫效果好.

人巨细胞病毒pp65 IgG-AI快速诊断试剂的临床应用

目的 评价人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)pp65 IgC-亲和力指数(Aviaity index,AI)快速诊断试剂的临床应用价值.方法 以自制的截短pp65重组蛋白作为诊断试剂,对本室血清库中保存的标本,采用ELISA间接法检测其特异性IgG抗体,分析该试剂的灵敏度、特异性和准确度.检测临床收集的89份患者血清标本(其中5例被明确诊断为HCMV活动性感染)的pp65 IgG抗体,并与意大利DIESSE公司IgG检测试剂盒结果进行比较.同时,对pp65 IgG阳性标本,运用尿素变性ELISA间接法检测其AI值,与意大利DIESSE公司IgM检测试剂盒结果进行比较,评价AI检测在HCMV感染诊断中的价值.结果 用pp65快速诊断试剂检测阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,灵敏度、准确度和特异性均达100%.两种诊断试剂IgG抗体检测结果,差异无显著意义.pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI＜60%标本共41份,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测ISM为阳性的仅有1份.临床明确诊断为HCMV肺炎的患者血清标本,诊断试剂检测AI值为可疑阳性,但参比试剂检测HCMV IgM抗体为阴性.结论 pp65 IgG-AI快速诊断试剂可初步诊断HCMV感染,简单快速,重复性好,具有良好的临床应用前景.

HIV检测试剂的发展及应用

人免疫缺陷病毒(Human immunedeficiency virus,HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)即艾滋病的病原体.

《中国生物制品学杂志》被两大国际重要检索刊物收录

乙型肝炎疫苗(WHO立场性文件)

遵照为成员国提供健康政策指导原则的要求,WHO正在定期发布一系列有关疫苗和联合疫苗的新立场性文件,这些疫苗是指可预防对全球公共健康造成危害的疾病的疫苗.这些文件主要针对大规模免疫接种.