日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达cDNA文库的构建和筛选

目的构建日本血吸虫病肝纤维化小鼠肝星状细胞差异表达基因的消减cDNA文库,并筛选差异表达基因.方法取日本血吸虫尾蚴经腹部感染小鼠致肝纤维化.采用抑制性消减杂交技术(SSH),分离小鼠肝星状细胞(HSC)及正常小鼠HSC,通过对比寻找差异表达基因.将其与T载体连接(T/A克隆),其产物转化大肠埃希菌DH5α,经文库扩增后,随机挑取白色克隆进行酶切鉴定,克隆经过正、反向杂交,阳性克隆经过测序和BLAST(局部相似性基本查询工具)进行表达序列标签(ESTs)差异基因分析.后经模拟Northern印迹确认基因表达差异.结果 扩增消减cDNA文库获得400余个白色阳性克隆,随机挑取的克隆经酶切鉴定后均有200～600 bp插入片段.ESTs分析获得76个序列,其中70个序列提示与血吸虫病肝纤维化或与其相关的基因,6个在公共数据库中未找到同源序列片段.结论 用SSH法及T/A克隆技术成功构建了肝纤维化小鼠HSC与正常小鼠HSC差异表达基因的消减cDNA文库.

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用.方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清.结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应.3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白 Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原 Mr24 000和 Mr15 000.双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%.结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景.

用电穿孔法将绿色荧光蛋白基因导入日本血吸虫童虫并表达

目的探讨增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在日本血吸虫童虫体内异源表达,以及电穿孔技术在血吸虫基因转化中应用的可能性.方法应用电穿孔技术将质粒pEGFP-C1 导入机械转化的日本血吸虫童虫体内,提取分离体外培养48 h童虫的基因组DNA、总RNA和全虫蛋白,分别用PCR、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证转基因在童虫体内的存在、转录和翻译.同时,使用激光共聚焦扫描显微镜对EGFP在童虫体内进行定位.结果 PCR和RT-PCR分别成功扩增出760 bp和276 bp的预期大小的片段,Western blotting 证实了EGFP基因在童虫体内的表达;激光共聚焦显微镜观察表明EGFP主要定位在童虫的皮层和副皮层,虫体前端尤为明显.结论电穿孔技术成功地将异源基因引入日本血吸虫童虫体内并获得表达.

黄果茄杀灭钉螺有效成分的分离提纯及其效果观察

目的分离提纯黄果茄果实灭螺的有效成分,观察灭螺效果,并确定其分子结构.方法将黄果茄果实去蒂去籽后干燥粉碎,用95%乙醇提取并浓缩,然后加乙酸乙酯处理,用薄层层析法(TLC)和柱层析法(CCL)对其进行分离,得到7种主要组份.采用"浸泡法"对其中4种含量较高的组分进行灭钉螺实验,确证Rf=0.58这一生物碱组分(A)为主要灭螺成分之一.选择佳洗脱剂对灭螺效果好组分A进行分离,得到A1及A2两组分.对A1,A2进行灭钉螺实验,比较其灭螺效果.电子轰击质谱测定有效成分分子量、核磁共振仪和红外光谱仪测定分子结构.结果黄果茄果实有效成分A(Rf=0.58)的灭螺效果较好,当投药量为2.50 mg/L,钉螺的死亡率为94.2%(28℃).乙酸乙酯-氯仿-甲醇(11∶11∶35)系统对A的分离效果好.灭螺对照实验发现:当A2投药量为0.20 mg/L,钉螺的死亡率为100.0%(28 ℃),其分子量为867,熔点为298～305 ℃.结论黄果茄有效成分提纯物 A2为边缘茄碱(α-solamarrgine),其对湖北钉螺有很好的杀灭效果.

十二烷基苯磺酸钠治疗蠕形螨病的实验和临床研究

目的观察十二烷基苯磺酸钠(SDBS)体外杀螨效果、治疗蠕形螨病的疗效及其安全性.方法①观察1%及2% SDBS体外杀螨效果.②临床观察2% SDBS软膏和2%甲硝唑软膏对蠕形螨病的疗效.确诊面部蠕形螨病患者62例,随机分为试验组和对照组(各31例),每天早、晚各1次将药物涂于患处,连续用药8周.用药前、后计数面部炎性损害、蠕形螨感染度及红斑评分,以评价疗效.③治疗8周后随访两个月,观察疗效及副作用.结果①体外杀螨试验,用药5 h,2% SDBS组的螨全部死亡,与2%甲硝唑组(69.4%)及花生油组(9.1%)比较,其差异均有显著性(P<0.05).2% SDBS杀灭毛囊与皮脂蠕形螨效果,两者间差异无显著性(P>0.05).②临床试验结果表明,炎性损害、蠕形螨感染度及红斑评分,2% SDBS组治疗前、后差异具有显著性(P<0.05).治疗后,2% SDBS组(87.1%)与2% 甲硝唑组(65.5%)有效率,差异具有显著性(P<0.05).随访结果无变化.③副作用:2% SDBS治疗皮脂蠕形螨病,3例局部有轻微烧灼感.结论 SDBS具有体外杀螨作用,治疗蠕形螨病安全有效.

微小按蚊密度评价灰色模型研究

目的借助气象、环境与遥感监测指标建立微小按蚊密度评价模型.方法以云南省10县27乡为研究现场,收集1984～1993年各乡气象、环境、遥感与蚊媒监测资料.对18 项指标与微小按蚊密度的关系进行灰色关联度分析,按照灰色阈值筛选评价指标,合成变量E,研究变量E与微小按蚊密度的关系,从而建立微小按蚊密度评价灰色模型.结果以0.70灰色阈值筛选微小按蚊密度评价指标并排列灰色关联序:干季月平均温度>干季低温度>湿季低温度>湿季归一化植被指数(NDVI)>湿季月平均温度>水田面积占耕地面积的比例>干季月高温度>湿季月高温度.微小按蚊密度灰色评价模型为:y=0.0578 e0.0780(8X10′+7X12′+6X11′+5X15′+4X9′+3X4′+2X8′+1X7′)模型判定的正确率为92.0%,e0.5=18%,大相对误差为-15%,小相对误差为 4%,平均相对误差为 21%.结论借助微小按蚊密度评价模型可以对疟疾疫点微小按蚊密度进行拟合评价.

上海市居室尘螨变应原浓度初步检测

目的检测上海市居室尘螨变应原浓度.方法 应用层析介质及蛋白质沉淀技术从螨代谢分泌物中分离、纯化粉尘螨变应原Dff F3及国际公认的变应原Der fⅢ,经临床检测和放射性变应原吸附实验(RAST)鉴定其变应原性.制备抗Dff F3和Der fⅢ IgG,从室内收集尘埃,分离尘螨抗原,夹心ELISA测定尘螨变应原Dff F3和Der fⅢ浓度.结果 Dff F3和Der fⅢ呈现强致变应性,均能与尘螨过敏哮喘患者血清IgE结合.检测200份家庭尘埃样品尘螨变应原,结果显示,Dff F3浓度>10 μg/g的家庭占57.0%,2～10 μg/g的家庭占29.5%,<2 μg/g的家庭占13.5%.Der fⅢ浓度>10 μg/g的家庭占53.5%,2～10 μg/g的家庭占32.0%,<2 μg/g的家庭占14.5%.结论 上海市部分居室尘螨变应原浓度偏高.粉尘螨Dff F3有较强的变应原性.

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体.方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting) 分析其特异性.结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在 1∶6 400～1∶51 200 特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2.所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白 Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应.结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体.

微小隐孢子虫卵囊DNA提取及用于PCR检测

目的采用3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并用于PCR检测以进行比较.方法微小隐孢子虫卵囊经多次冻融加热破壁后,采用螯合树脂(Chelex-100)、酚/氯仿和基因组DNA纯化系统试剂盒3种方法提取微小隐孢子虫卵囊DNA,并根据微小隐孢子虫基因序列(L16996)设计一对寡核苷酸引物,分别对3种方法制备模板进行PCR扩增分析.Chelex-100提取的DNA也用于观察PCR检测的敏感性.结果 3种方法制备的微小隐孢子虫卵囊模板用于PCR检测均获得1条446 bp条带,Chelex-100提取的DNA用于PCR检测的敏感性至少达0.5个卵囊.结论 3种方法提取的微小隐孢子虫卵囊DNA均可用于PCR检测,Chelex-100法是一种高效而快速的微量提取DNA方法,适用于对隐孢子虫DNA的检测.

腹部超声显像指标诊断血吸虫病患病的一致性分析

目的探讨不同B超指标诊断日本血吸虫病患病的一致性程度和佳指标组合.方法 选取6个B超指标对湖南省汉寿县全兴村居民血吸虫病病情进行调查,计算不同B超指标之间的诊断一致性系数Kappa值和不同B超指标组合内部一致性的克朗巴哈α系数.结果 以"肝实质Ⅱ级以上"与"肝锁骨中线肋下"和"肝门脉内径"的一致性系数Kappa值较高,分别为0.4131和0.4655,仅为中等程度的一致性,其余为弱一致性或无明显一致性.在不同B超指标的组合中,以"肝实质Ⅱ级以上"、"肝锁骨中线肋下"和"肝门脉内径"3个指标组合的克朗巴哈α系数大,为0.6566,具有较强的内部一致性.结论 6个B超指标不应该互相替代评估血吸虫病患病,在广泛应用B超评估血吸虫病患病之前,有必要对这些B超指标间的诊断一致性及其佳组合进行研究.

铁螯合剂类抗疟药的研究进展

疟疾是危害人类健康的重要寄生虫病.据统计,全球约有40%人口受到威胁,每年发病人数为2.5～3亿,其中死亡人数约200万[1].对多种抗疟药具有抗性的恶性疟原虫正迅速扩散.因此,研制并开发新型抗疟药对控制全球疟疾具有重大意义.铁螯合剂作为一种新型抗疟化合物,近年来备受关注.

寄生线虫性别特异表达基因研究进展

常见的重要寄生线虫,如:蛔虫、丝虫、毛首线虫、旋毛虫等,严重危害人类健康及畜、禽产品的产量和质量,药物防治已取得一定成效.但由于药物残留和耐药性问题,以及常规寄生虫疫苗保护力低下的原因,采用新的策略来预防和控制寄生虫病已经成为目前研究者探索的目标.从寄生虫自身的生殖发育调控机制入手,通过阻断或干扰线虫的某个或几个生殖发育阶段,可以达到控制线虫病的目的.目前这方面的研究主要集中在鉴定并阐明和线虫性别相关的基因,即性别特异基因的表达情况及其功能推测.

我国嗜人按蚊和雷氏按蚊分类地位的探讨

我国嗜人按蚊和雷氏按蚊的分类地位虽经多次修订,其存疑问题迄今未获解决,蚊媒分子鉴别研究的发展为澄清问题提供了有利条件.本文综合国内外文献作历史性回顾评述,并根据分子鉴别研究新进展对我国嗜人按蚊和雷氏按蚊的分类地位和正确命名修订作探讨.

夏厕蝇幼虫致人胃蝇蛆病一例

患者,女性,49岁,农民,汉族,河南省南阳市卧龙区张庄村人.胃部不适两月余,近来症状加重,持续性胃部胀满、恶心、嗳气、食欲不振.2004年7月9日吐出约几百条黑色活动小虫.遂将部分虫体装入玻瓶送本室鉴定.虫体均活动,123条,长6～13 mm,呈黑褐色,腹背稍扁,中部较宽,两端窄小.虫体14节,除前 1 节外,每节背面及侧面均具棘状突起,愈近后端愈长,腹面有短细毛.镜下观察,各腹节腹面表皮有鳞状饰纹.在第8腹节的后截面中央有1对后气门,长在隆起的杆上.经郑州大学医学院寄生虫学教研室及本室鉴定为厕蝇属夏厕蝇(Fannia canicularis linnaeus,1761)幼虫(图1).

云南省曲靖市细粒棘球蚴病一例

患者女性,31岁,云南省曲靖市沾益县德泽乡人.3年前B超检查肝左外叶囊性占位性病变,怀疑肝囊肿.2003年3月B超复查囊肿明显增大.2004年4月彩色B超查见肝左外叶约(8.4×7.6×6.9) cm 的囊性无回声区,边界清楚,透声良好,诊断为肝囊肿.当天局部麻醉,行B超引导下肝囊肿穿刺,抽出的无色透明液体(277 ml)中见许多淡黄色小颗粒状物.75%乙醇蛋白定性试验,2次均阴性.抽出液分别送本院检验科及昆明医学院寄生虫学教研室检查.送检液体无色透明,其中悬浮许多细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的原头蚴及囊壁碎片(图 1),确诊为肝细粒棘球蚴病,行肝棘球蚴病手术切除治疗.术后口服阿苯达唑[20 mg/(kg·d)连服1个月,共 2 个疗程,间隔10 d].

眼结膜吸吮线虫感染一例

患者,女性,26岁,江苏省张家港市人,现在上海市工作.2004年6月20日起右眼结膜有异物感,持续月余.7月21日右眼上结膜异物感难忍,用手揉出 1 条长约 1.3 cm白色线状虫体,当即去眼科医院就诊.B超检查未见明显异常,诊断为右眼结膜炎.给予0.9% 氯化纳注射液和硫酸庆大霉素交替冲洗右眼,泰利必妥眼药水滴注.次日中午,右眼再度出现异物感,并充满整个结膜.再次去医院就诊,予生理盐水棉签擦拭眼结膜,检出 6 条虫体,异物感症状消失.

高强度聚焦超声治疗巨大肝泡球蚴病一例

患者,男性,58岁,河南省洛阳市人,青壮年时在青海工作 9 年,后调回洛阳.10 年前在洛阳体检时发现右肝有5.0 cm×5.0 cm 占位性病变,怀疑肝癌.经北京、上海医院检查,右肝占位,良性肝海绵状血管瘤、囊腺瘤可能.当时尚无临床症状.10 年来不定期B超和CT复查,肿块逐渐增大,右肝区隆起,肋下肝脏可触及.因右上腹疼痛、牵拉、腰不能直立,肝区疼痛,消瘦明显,于 2003 年 9 月入院.右上腹及剑突下隆起包块,可触及,B超检查为12.0 cm×10.0 cm,表面不光滑,质地如软骨.

巴基斯坦输入性间日疟一例

患者,男性,28岁,工人.4 周前突发寒战、高热,体温 40 ℃,伴头昏、胸痛、乏力及全身肌肉酸痛,予以扑热息痛、抗生素及激素治疗,退热.近2周出现间歇性畏寒、发热伴头昏、胸闷,于2004年1月26日入院.

青岛地区大学生面部蠕形螨感染情况调查

人体毛囊蠕形螨与皮脂蠕形螨主要寄生于面部毛囊与皮脂腺.为了解青岛地区大学生面部蠕形螨的感染情况,作者于2004年夏、冬两季对578名大学生进行了调查.

人体寄生虫学理论和实验教学改革探讨

长期来,对人体寄生虫学教学方法、手段以及教学体系的改革,总体上未摆脱传统教育模式.近年来,由于种种原因,许多寄生虫病方面的有关内容未能在临床教学向学生讲授,致使医学生5年课程仅学到人体寄生虫学基础知识,有关寄生虫病临床知识十分有限.目前,我国寄生虫病发病率仍较高,危害较大.系统掌握其发病机制、临床诊断及防治,对于提高寄生虫病确诊率、减少漏诊、误诊十分重要.作者认为,教学改革应考虑本学科的整体发展与综合化,精选知识、合理设置教学内容与课程体系,注重与其他学科相关知识融合,整体优化理论教学和实验教学.使学生及时了解本学科发展动向、前沿技术,不断拓宽视野.

2000～2004年孝昌县周巷镇低年龄组疟疾发病潜势分析

湖北省孝感市孝昌县属国家贫困县,多年来疟疾(间日疟)疫情呈波浪式发展态势[1].周巷镇为其边缘大镇,与孝南区的双峰林区及黄陂县交界,总人口6.3万,有41个行政村,356个村民小组.主要农作物为水稻,属亚热带季风气候,适宜于按蚊孳生和疟疾传播.为了更好地控制当地疟疾疫情,现将周巷镇2000～2004年2月龄～10岁低年龄组人群疟疾疫情分析如下.

青海省人体重要寄生虫病地区分布调查

青海省地处青藏高原,平均海拔 3 000 m 以上.辖 1 市、1 地、6 州.总面积 72万 km2,人口530万,平均人口密度为7.26人/km2.其中,西宁市和海东地区面积占全省的3%,人口占全省的67%; 而牧区面积占全省的97%,平均人口密度不足4人/km2.青海省是我国主要牧业基地之一.为了解全省人体寄生虫感染及地区分布现状,作者于2002～2003年,按照<全国人体重要寄生虫病现状调查方案>对本省6种人体重要寄生虫病进行了调查.

淮南地区华支睾吸虫病临床资料分析

华支睾吸虫病(clonorchiasis)是由华支睾吸虫成虫寄生于人肝胆管引起的一种严重危害人类健康的人兽共患病.淮河流域是重要流行区之一,其中淮南地区的发病率较高[1].该病易于继发肝胆系统其他疾病[2].作者对淮南地区华支睾吸虫病临床特征作了分析,以便为防治本病提供参考.

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白的纯化、酶学活性及免疫学研究

目的体外制备华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶重组蛋白(CsGAPDH),分析其酶学活性及免疫学特性.方法常规表达重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),用凝血酶和纯化柱酶切、纯化的CsGAPDH免疫BALB/c小鼠,制备抗血清.ELISA检测抗IgG抗体滴度,浓缩型S-P免疫组化3步法检测CsGAPDH抗原在免疫小鼠体内的分布和表达.蛋白质印迹法(Western blotting) 鉴定其抗血清的特异性.建立酶反应体系测定重组蛋白CsGAPDH的酶催化活性.结果纯化蛋白样品呈单一条带.免疫动物获取 CsGAPDH 抗血清,在免疫过程中抗体滴度呈连续上升趋势.CsGAPDH抗原分布和表达于小鼠肌细胞膜部位.免疫小鼠血清具有抗 CsGAPDH特异性抗体.重组蛋白CsGAPDH具有酶生理活性,其酶活力单位为 2 872 U min-1·ml-1.结论制备的重组蛋白 CsGAPD H具有较好的酶活性和免疫原性.

吉曼尼兹(Gimenez)染色法快速筛选阿米巴滋养体内嗜肺军团菌

目的寻找简便、有效的染色方法,用于快速筛选阿米巴滋养体内嗜肺军团菌.方法嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)与多噬棘阿米巴(Acanthamoeba polyphaga)共培养,取不同时点的共培养物制作涂片,采用革兰氏染色、吉曼尼兹(Gimenez)染色、姬姆萨(Giemsa)染色、免疫荧光染色等多种方法,用光学显微镜及荧光显微镜观察鉴别阿米巴滋养体与其胞内嗜肺军团菌,并比较这些染色方法的效果.结果 Gimenez染色方法效果较好.虫体呈蓝色、嗜肺军团菌呈红色,两色分明.在共培养初期即可观察到阿米巴滋养体胞内少量的杆状嗜肺军团菌.本法灵敏度高,省时、耗材少,操作简便.结论 Gimenez染色对阿米巴滋养体胞内嗜肺军团菌形态学检测具有实用价值,适合于实验室检测和临床诊断应用.

旋毛虫Ts87抗原基因在毕赤酵母中的构建及表达

目的构建旋毛虫Ts87抗原基因并在毕赤酵母中分泌表达.方法 通过PCR特异性扩增Ts87抗原基因,构建重组质粒PPICZαA-Ts87.其线性化后,转化毕赤酵母GS115,抗生素Zeocin 筛选高抗性转化子,PCR筛选阳性重组菌株.表型鉴定后进行甲醇诱导表达,收集培养不同天数的上清液.斑点杂交法分析上清液以确定有无重组蛋白分泌表达.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析鉴定表达蛋白.结果与结论 成功构建了PPICZαA-Ts87毕赤酵母表达重组质粒,确定了Ts87抗原基因在毕赤酵母中获得分泌表达.

获奖与感谢