新生鼠缺氧缺血时脑TPA活性与微血管基膜的相关性研究

为了探讨缺氧缺血时脑内组织型纤溶酶原激活物(TPA)与脑微血管基膜降解的相关性,本研究采用了下述二种方法:第一组是将一日龄SD大鼠分为五组:(1)空白对照组,(2)假手术组,(3)缺氧缺血组,(4)缺氧缺血后复氧24 h组,(5)缺氧缺血后复氧48 h组,每组12只.每组取4例测TPA活性和8例鼠脑用抗Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白抗体标记.第二组是脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞体外培养:分为(1)空白对照组,在常规条件下培养的细胞;(2)缺氧组,在培养液表面覆盖无菌医用液体石蜡,形成缺氧环境,每组取8例培养液测TPA活性.结果证明,在三个实验组中以缺氧缺血组的TPA活性高,而后随着复氧时间的增加而下降.培养的内皮细胞缺氧组TPA活性比对照组高,而星形胶质细胞缺氧组TPA活性与对照组无差别.三个实验组的Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白阳性染色平均单位面积较两对照组者小.三个实验组阳性产物呈不连续线状的微血管数较两对照组多.以上结果显示,缺氧缺血可激发新生大鼠脑内TPA活性增高,主要是脑微血管内皮分泌的TPA活性增高,然后通过一系列酶促反应,使微血管基膜的细胞外基质成分-Ⅳ型胶原、层粘连蛋白和纤维粘连蛋白等降解,血脑屏障受损,微血管的渗透性增加,脑水肿.

GDNF及dvHSV-GDNF对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的影响

为了探讨胶质细胞源性神经营养因子及单纯疱疹病毒载体介导的胶质细胞源性神经营养因子(dvHSV-GDNF)对坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的作用,本实验对成年大鼠造成双侧坐骨神经损伤后,于右侧损伤处分别施加胶质细胞源性神经营养因子和dvHSV-GDNF;左侧损伤处施加生理盐水作为对照.分别取损伤后4、7、14和28 d大鼠的脊髓L4～L6节段,经石蜡包埋切片后行Nissl染色,计数前角运动神经元数量并进行统计学分析. 结果发现:坐骨神经损伤后4、7、14和28 d,右侧脊髓前角运动神经元的数量明显高于左侧.提示:胶质细胞源性神经营养因子和dvHSV-GDNF可减少坐骨神经损伤大鼠脊髓前角运动神经元的死亡.

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的神经型烟碱受体电流

本实验采用膜片箝技术观察了神经生长因子分化5～10 d的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞上烟碱受体离子通道电流.在全细胞膜片箝条件下,当箝制电压为-80mV时,灌流乙酰胆碱(ACh, 30 μmol/L)诱发一内向电流,快速始发并衰减.此乙酰胆碱诱发电流(IAch)随膜去极化和超级化而分别减小和增大,且被筒箭毒所阻断,可见此电流是由烟碱受体引起的.全细胞IACh呈较强的内向整流.其衰减相可被一双指数函数拟合,时间常数(τ)分别在秒和分级.τf对浓度的依赖性较τs强.PC12细胞表面含有与交感神经元相似的烟碱受体,因此提供了一个交感神经元样的同源细胞株.它是研究神经烟碱受体调节的一个很好的模型系统.

豚鼠耳蜗Hensen细胞的分离、活性鉴定及其胞内静态游离Ca2+分布

使用酶消化法及机械分离法对Hensen细胞进行分离,置于倒置显微镜下用碘化丙啶及钙敏荧光染料Fluo-3进行细胞活性鉴定并在激光扫描共聚焦显微镜下观察静息状态Hensen细胞内的游离Ca2+的时空分布.结果证明,每个豚鼠耳蜗可以得到单离的Hensen细胞5～12个.细胞活性良好,可保持5～6 h.当细胞变性、坏死时可见一系列的形态学变化.对此得出几点判断Hensen细胞活性的标准:(1)细胞体呈卵圆形或椭圆形,大小可不一致;(2)细胞膜完整,细胞边界清楚,折光现象明显;(3)细胞浆清澈透明,无布朗运动,无溢出;(4)细胞浆内的脂滴清晰可辨,折光现象明显;(5)细胞无水肿(即无气球样变).在静息状态下,Hensen细胞内的Ca2+在细胞内分布不均匀,脂滴所在部位没有Ca2+的分布.随时间延长,细胞内的[Ca2+]i可小幅度振荡,但基本处于一种稳定状态.本工作为进一步对Hensen细胞的其他特性进行研究打下了基础.

针刺对脑源性神经营养因子在脊髓Ⅱ板层可塑性中表达的影响

采用免疫组化和原位杂交技术,探讨了针刺促进脊髓Ⅱ板层可塑性过程中脑源性神经营养因子及其mRNA表达的变化.结果显示:针刺侧备用背根节的脑源性神经营养因子及其mRNA 阳性中(42～57 μm)、小(＜42 μm)型神经元的百分数有所增加(P＜0.05);脊髓Ⅱ板层的脑源性神经营养因子的阳性神经膨体密度明显增多(P＜0.01)而阳性神经元百分数无变化(P＞0.05);针刺后脊髓Ⅱ板层未见脑源性神经营养因子mRNA的杂交信号.提示针刺促进脊髓Ⅱ板层可塑性可能与背根节中、小神经元表达脑源性神经营养因子的增多有关.

衰老时大鼠大脑皮质枕叶一氧化氮合酶阳性神经元的变化

本实验采用免疫组化SABC法结合计算机图像分析技术,研究了衰老时大鼠大脑皮质枕叶一氧化氮合酶阳性神经元的分布及形态特征变化.结果发现:一氧化氮合酶阳性细胞在枕叶皮质Ⅱ～Ⅵ层均有分布,属于非锥体形神经元;比较三个年龄组阳性细胞的数量和平均截面积的变化,发现老年组与幼年组及中年组相比,两项指标都显著减小(P＜0.01).而幼年组和中年组相比两项指标没有明显差别(P＞0.05).提示,一氧化氮作为神经递质,可能与大脑皮质枕叶功能的调节有关;随着衰老,其阳性神经元的变化可能影响其发挥正常的生理功能.

大鼠孤束核内含calbindin D-28K的内脏伤害性神经元向终纹床核的投射——荧光金标记结合免疫荧光技术研究

既往的研究证明孤束核和终纹床核参与内脏伤害性信息的传递和调控.Calbindin D-28K是钙结合蛋白家族的成员,为神经细胞特别是投射神经元的选择性标记物.应用荧光金逆行追踪和免疫荧光技术相结合的方法,对给予内脏伤害性刺激后大鼠孤束核内FOS的表达并显示Calbindin D-28K免疫阳性的神经元向终纹床核的投射进行了研究.结果显示:将荧光金注入一侧终纹床核外侧部后,孤束核中尾段内双侧出现荧光金逆行标记细胞,注射区同侧占优势:孤束核的相同平面可观察到双侧等量分布的免疫反应阳性的Calbindin D-28K和FOS细胞:三种阳性细胞的分布有明显的重叠现象.在其重叠分布区可见荧光金/Calbindin D-28K、FOS/Calbindin D-28K、荧光金/FOS双重阳性以及荧光金/Calbindin D-28K/FOS 三重阳性细胞.除FOS/Calbindin D-28K双重阳性细胞为双侧分布外,荧光金/Calbindin D-28K、荧光金/FOS双重阳性以及荧光金/Calbindin D-28K/FOS三重阳性细胞的出现均以注射区同侧为主.荧光金/Calbindin D-28K、FOS/Calbindin D-28K双重阳性和荧光金/Calbindin D-28K/FOS三重阳性神经元占孤束核内Calbindin D-28K免疫阳性神经元总数的百分比分别为2.79%、15.3%和2.56%;荧光金/Calbindin D-28K/FOS三重阳性神经元占孤束核向终纹床核投射的Calbindin D-28K免疫阳性神经元的百分比为47.8%.本研究结果提示,由孤束核中继并向终纹床核传递的内脏伤害性信息传导通路中Calbindin D-28K可能发挥重要作用.

细胞外信号调节激酶系统(ERKs)在正常发育和单眼剥夺大鼠视皮层蛋白表达的研究

为了研究正常发育和单眼视觉剥夺大鼠视皮层ERK1/ERK2基因蛋白质表达的变化，本研究建立了SD大鼠单眼视觉剥夺模型，以多克隆抗ERK1/ERK2 抗体和单克隆抗双磷酸化ERK抗体检测出生后第1、14、21、28、45 d和成年(90 d)正常发育和单眼视觉剥夺(14～45 d)视皮层ERK1/ERK2蛋白表达和活性改变。结果表明，出生后大鼠视皮层ERK1/ERK2蛋白表达逐渐增加，至45 d达到高峰，此后下降至成年达稳定水平。磷酸化ERK蛋白表达仅见于成年大鼠视皮层。单眼视觉剥夺导致ERK1/ERK2蛋白表达减少。提示ERK的蛋白表达依赖于正常的视觉输入信号的刺激，异常的视觉经验造成表达的明显下调，阻断正常的发育进程。说明ERK1和ERK2可能参与发育敏感期视皮层神经元可塑性的调节。

吗啡依赖大鼠背根节神经元胞体的光镜和电镜定量研究

在吗啡依赖条件下,观察了脊髓Ⅱ板层发生轴突终末侧支生芽和建立新突触的背根节神经元的胞体是否出现相应的形态变化.应用光镜体视学方法,结合电镜观察和测量,比较吗啡依赖组与对照组背根节体积及其神经元胞体、胞核、核仁、粗面内质网和线粒体的体积变化.结果显示:吗啡依赖组背根节体积与对照组比较未发现差异,背根节内的亮、暗两类神经元的胞体、胞核、核仁体积以及胞质内粗面内质网和线粒体体积也无显著性差异.结果表明,吗啡对大鼠背根节神经元胞体的形态结构没有明显的影响.

缺氧复氧时培养的大脑皮质神经细胞一氧化氮动态变化及银杏叶提取物的调节作用

本研究用原代混合培养的Wistar胎鼠大脑皮质神经细胞,给予不同时间的缺氧复氧,观察其一氧化氮的代谢中间产物亚硝酸盐的动态变化以及诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍和银杏叶提取物对一氧化氮的调节作用.结果表明:缺氧复氧可造成培养大鼠的大脑皮质神经细胞一氧化氮双相升高.即:在缺氧早期(缺氧2 h)可见一氧化氮一过性升高,然后很快恢复至正常水平;在缺氧8 h、复氧18 h后可见第二次一氧化氮升高.于缺氧前1 h在细胞培养上清液中分别加入氨基胍(0.5 mmol/L)和银杏叶提取物(50 μg/ml),发现氨基胍可有效地抑制缺氧复氧晚期培养的大鼠大脑皮质神经细胞一氧化氮升高,但不能抑制缺氧早期一氧化氮的产生;而银杏叶提取物可有效地抑制缺氧复氧诱导的一氧化氮双相升高.提示:在混合培养的胎鼠大脑皮质神经细胞缺氧复氧损伤模型中,一氧化氮的双相升高是由不同亚型的一氧化氮合酶所介导,其早期升高可能为神经元型一氧化氮合酶活性上调所致,而其晚期升高则是诱导型一氧化氮合酶活性增强的结果;银杏叶提取物可抑制缺氧复氧时神经元型和诱导型一氧化氮合酶的活性从而降低一氧化氮的产生而完成其神经保护作用.

人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析

为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗Alzheimer病中的作用,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析.提取健康成人末梢血白细胞基因组DNA作为模板,应用PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段,并将其插入pGEM-T质粒.限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析.与GenBank提供的已知序列(M61181)比较,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长357 bp,序列完全相同.人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆,为其在原核细胞中的表达、抗体的制备及神经系统疾病的治疗奠定了基础.

正常成年Wistar大鼠海马结构苔藓纤维的分布

用Timm显影染色方法,研究正常Wistar大鼠海马结构苔藓纤维的分布.结果苔藓纤维主要集中在门区和CA3区透明层,但在CA3区始层所有大鼠都多少不等地有银染颗粒即苔藓纤维终扣分布,8/20只大鼠甚至达到2至3级,呈稀疏到浓密条带状,此点与既往的报道不同;还有13/20只大鼠在齿状回有较多苔藓纤维呈条束状由门区发支穿越颗粒细胞层.

部分去背根猫备用背根节和脊髓Ⅱ板层NT-3及其mRNA的表达变化

采用免疫组化和原位杂交技术探讨了部分去背根猫备用背根节(L6)和L3、L5脊髓II板层NT-3 及其mRNA的表达变化.结果发现,正常组NT-3及其mRNA阳性产物主要分布于背根节的大型神经元和少数中、小型神经元.部分去背根后,3 d和10 d两时相NT-3 mRNA大型神经元阳性数明显减少,而NT-3阳性大型神经元数术后10 d时方明显减少(P<0.01); NT-3及其mRNA阳性小型细胞数在术后两时相均较正常组者增多(P<0.01);而在中型神经元只有NT-3阳性神经元数有增加.相对地,在脊髓Ⅱ板层,两时相NT-3阳性神经元及胶质细胞百分数均较正常者明显增加(P<0.01),且以3 d组者为明显,但均未见NT-3 mRNA阳性信号.结果表明,部分去背根不仅导致背根节各类神经元中NT-3的表达发生了变化,且对Ⅱ板层NT-3阳性神经元及胶质细胞数量也有明显影响.提示NT-3可能在脊髓Ⅱ板层可塑性中发挥作用.

左侧视网膜剥夺鸽右视盖差异表达基因的克隆与鉴定

采用抑制消减杂交技术构建左侧视网膜剥夺后右视盖基因差异表达的文库,研究在无光刺激的条件下视盖发育受阻的分子机制.随机测序21个序列,6个序列经反Northern 证实为真阳性,3个序列未发现明确的同源序列,另外3个分别与homo sapiens SH3GL2、G.domesticaus、 transthyretin有较高的同源性.21个序列中,11个基因片段被分配序列号.这些结果为深入研究视觉发育提供了有益的线索.

穹窿海马伞损伤对大鼠学习记忆和海马GFAP阳性神经胶质细胞的影响

为探讨穹隆海马伞损伤鼠学习记忆能力与海马胶质纤维酸性蛋白阳性细胞之间的关系.切断SD成年大鼠左侧穹窿海马伞，用Y迷宫和免疫组织化学结合图像分析系统测试大鼠学习记忆能力和海马胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的变化状况及它们的相互关系。结果显示：损伤2周后，损伤组损伤侧海马CA1区辐射层和齿状回分子层胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的数密度较正常组分别增多30.29％和30.15％(都为P<0.01)，胞体面积分别增加16.04％和1 9.42％(都为P<0.01)，齿状回分子层胶质纤维酸性蛋白阳性细胞体密度增大19.40％(P<0.05)。经相关分析，大鼠学习记忆能力与海马CA1区胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数密度呈负相关(r=-0.836，P<0.01)，与齿状回数密度呈负相关(r=-0.792，P<0.01)。提示海马星形胶质细胞可能参与学习记忆过程。

大鼠室管膜下区和齿状回神经前体细胞增殖的衰老性变化

为了观察大鼠脑内神经前体细胞增殖的增龄性变化、探讨其在脑老化机制中的作用,本研究取不同年龄的大鼠经腹腔注射BrdU标记处于增殖状态的神经前体细胞,用抗BrdU抗体进行免疫组化反应,镜下观察脑内神经前体细胞的分布,并计数作定量分析.结果发现,各年龄组的室管膜下区及齿状回颗粒下层有BrdU阳性细胞分布;上述各部位BrdU阳性细胞数和标记率均呈明显的增龄性下降,幼年组和青年组之间,以及青年组和老年组之间的差异均有非常显著性意义(P<0.01).结果表明,神经前体细胞的增殖能力随衰老而明显下降.这可能与衰老脑的神经元补偿能力及神经可塑性降低有关.

单侧外周伤害性刺激诱发大鼠脊髓中转录因子CREB的双侧磷酸化

cAMP反应成分结合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)是一种转录因子,它在磷酸化之后可调节靶基因的转录.CREB在133位置的丝氨酸的磷酸化,与脊髓中伤害性传入的处理有关,本文作者等用特殊抗体对此进行了免疫细胞化学研究.在正常大鼠,虽然几乎所有脊髓神经元的核中都可见CREB的轻度着色,但磷酸化的CREB仅见于双侧腰段脊髓的Ⅰ～Ⅱ层(75±15 vs 60±18)和Ⅹ层(9±3).用福尔马林注射引起一侧后脚掌出现炎症时,可在双侧腰段脊髓看到磷酸化CREB细胞核的快速(小于5 min)和节段性的显著增多;它们主要分布在双侧背角表层Ⅰ～Ⅱ层(254±20 vs 262±23)、Ⅹ层(115±13)和双侧Ⅴ～Ⅷ层(346±20 vs 328±26);而在对照和炎症组大鼠的胸段脊髓中均未见磷酸化CREB的增加.在注射CFA诱发一侧炎症或切断一侧坐骨神经的实验组大鼠,也可看到至少延续到第三天的强而双侧性的CREB的磷酸化.这种由一侧后肢伤害性传入引致腰段脊髓中镜像式双侧CREB磷酸化的出现,与一般看到的损伤传入只在同侧脊髓背角引起某些神经化学改变的结果不同,可能是人神经损伤后或在实验动物中出现对侧镜像式疼痛过敏现象的基础.

脑源性神经营养因子在成年猴脑的分布

采用免疫组织化学方法探讨了BDNF在成年猴脑的分布.结果显示,脑源性神经营养因子阳性反应产物主要分布于下列结构:大脑皮层III～V层的锥体细胞及突起;小脑皮质篮状细胞、Purkinje细胞、Golgi细胞及小脑顶核的神经元及其突起;海马各区的神经元、纤维和齿状核的颗粒细胞;尾状核、豆状核和室旁核部分神经元和纤维;脑干脑桥核、舌下神经核、迷走神经背核、前庭神经核、下橄榄核及网状结构的神经元及纤维或膨体.此外,在大、小脑的白质也可见到部分脑源性神经营养因子阳性胶质细胞.脑源性神经营养因子阳性反应产物广泛地分布于猴脑的多种区域和细胞,提示其功能可能涉及不同类型的神经元及可能的非神经细胞.本研究结果为探讨脑源性神经营养因子在成年猴脑的分布规律及其功能特点提供了有用的形态学依据.

肌源性神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧时Bcl-2表达的影响

为证明大鼠肌源性神经营养因子对损伤神经的保护作用,本文观察了此因子对缺氧时体外培养的大鼠脊髓运动神经元Bcl-2表达的影响.本实验从成鼠和乳鼠骨骼肌中提取肌源性神经营养因子,取100 μl (0.1 μg/ml)加入培养的胚胎大鼠脊髓运动神经元的培养液中,对照组加入等量的PBS.然后用液体石蜡封闭液面造成神经元缺氧损伤,3 d后行Nissl染色和免疫组化反应,观察和计数大鼠脊髓运动神经元存活数以及Bcl-2免疫反应阳性神经元数,并对Bcl-2阳性神经元作平均光密度分析.结果发现: 经成鼠和乳鼠肌源性神经营养因子孵育的脊髓运动神经元缺氧后的神经元存活数、Bcl-2阳性神经元数以及平均光密度均明显高于对照组,但乳鼠肌源性神经营养因子的效果更好.提示:大鼠肌源性神经营养因子能增强缺氧时脊髓运动神经元Bcl-2的表达,抑制缺氧后运动神经元的死亡,以乳鼠肌源性神经营养因子的效果为好.

周围神经损伤与再生中的巨噬细胞

非神经细胞在周围神经损伤和再生中的作用早已引起人们的关注.近年来,越来越多的学者对神经损伤和再生中的巨噬细胞进行了有关的研究,使人们对巨噬细胞在这一过程中的聚集、识别、吞噬及其与轴突再生、其他非神经元细胞间的关系有了更深入的认识.本文谨对目前有关这方面的研究作一简要综述.

脑源性神经营养因子与帕金森病

帕金森病(PD)的主要病理特征是中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺(DA)能神经元的进行性退化变性,由于其机制还不清楚,因而限制了此病的临床治疗.脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)由Barde等于1982年在猪脑中首次发现,其氨基酸序列有55%～60%与神经生长因子(nerve growth factor, NGF)完全相同,也属神经营养素(neurotrophin)家族的成员,BDNF可通过其高亲和力受体trkB和低亲和力受体p75NTR发挥生物活性,能够促进多种神经元的存活,尤其对DA能神经元有很强的营养和保护作用,因而受到了广泛的关注,被认为是治疗PD的新一代药物.但是对于BDNF在PD发生、发展中的作用和意义一直未有定论,近年来的一些研究结果为该问题提供了一些有意义的答案.

宰经科学历史人物传略连载(一) Camillo Golgi的生平简介