LPS、rh-TNFα刺激PBL诱导TRAIL表达的初步研究

选择人PBL作为人TRAIL基因的来源,抽提细胞在LPS 和rh-TNF α刺激2、10、18h的总RNA,通过RT-PCR观察TRAIL基因转录mRNA的水平,然后用PCR扩增TRAIL基因,并用免疫印迹法分析TRAIL mRNA翻译蛋白的水平.结果发现:在LPS和rh-TNFα刺激细胞并进一步诱导细胞凋亡可能与诱导表达TRAIL有关.本实验得到了TRAIL基因,为重组表达TRAIL打下了基础.

乙型肝炎表面抗原124aa分子在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链反应特异性扩增编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)羧基末端124个氨基酸的基因片段,并将其在大肠杆菌中获得了高效表达.表达产物氨基末端有1个含6组氨酸肽段的20氨基酸融合部分,分子量16178Da,以包含体形式存在,约占细菌总蛋白的22%.以HiTrap亲和层析纯化,纯度可达95%以上.分别用抗HBsAg多克隆抗体和抗HBsAg a单克隆抗体进行ELISA检测表明,该蛋白具有HBsAg反应原性.

凋亡对肿瘤细胞表面抗原活性的影响

通过以常规免疫法和削减免疫法分别制备抗κB凋亡细胞相关抗原的抗体Ab1和Ab1a,以ELISA法检测抗原抗体反应,观察肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原活性的变化及新抗原的表达.结果显示Ab1与κB凋亡及非凋亡细胞的表面相关抗原均有较强反应,而Ab1a只与凋亡细胞表面抗原反应较强.由此可证明肿瘤细胞在凋亡过程中表面相关抗原活性并未明显降低,同时有新的抗原分子表达.

跨膜型CD59分子的构建及其在小鼠NIH3T3和EL-4细胞表达的研究

应用RT-PCR方法,从U937细胞总RNA中扩增得到编码人CD46分子跨膜区和膜内区cDNA片段,用PCR方法扩增得到编码成熟的CD59胞外区蛋白的cDNA片段,连接并构建了跨膜型的CD59分子cDNA.快速克隆于pGEM-T Easy载体进行序列测定,证实了其阅读框的完整和序列的正确性.进一步将cDNA重组于逆转录病毒pLXSN载体,电穿孔转染PA317细胞,用病毒上清感染小鼠NIH3T3、EL-4细胞,经FACS检测筛选获得表达重组CD59TM分子的阳性细胞克隆.本研究为更深入地研究GPI锚固的CD59分子与细胞活化信号转导的关系建立了可靠的细胞模型;同时也为探讨应用跨膜型的CD59分子对PNH进行基因治疗奠定了良好的基础.

TGF-β1诱导HL-60细胞株凋亡作用的研究

为探讨转化生长因了β1(TGF-β1)在体外诱导早幼粒细胞白血病细胞株(HL-60)凋亡的作用及其相关的细胞和分子机制,本实验以TGF-β1在体外对HL-60细胞株作用,通过电镜、TUNEL法、流式细胞仪、免疫细胞化学等实验方法,观察TGF-β1对HL-60细胞株凋亡的诱导作用,以及相关基因的表达变化.实验发现TGF-β1可显著诱导HL-60细胞凋亡,TGF-β1下调HL-60细胞bcl-2、c-myc基因的表达可能是其诱导凋亡的分子机制之一.

为寻求丙型肝炎病毒基因免疫的佳动物实验方法,探讨不同处理方式对重组体pCD-HCV1诱发Balb/c小鼠产生抗体的影响.采用分子生物学技术构建了HCV重组体,用不同免疫次数、途经、剂量和不同处理方式将其免疫小鼠.结果显示:重组体pCD-HCV1(100μg/只/次,n＝12)经肌肉1次、2次、3次和4次免疫小鼠后,抗体水平分别为0.183±0.06,0.428±0.05,0.707±0.08(OD410值,下同),其中4次免疫组抗体水平高;小鼠经灌胃、腹腔注射、皮下注射和肌肉注射(100μg/只×3次)不同途径分别免疫小鼠(n＝6),抗体水平依次为0.138±0.05,0.178±0.07,0.233±0.08和0.691±0.05;以不同剂量(10μg,50μg,100μg)分别免疫鼠(n＝8),抗体水平依次为0.110±0.09;0.330±0.04和0.700±0.07,各组间差异均有显著性意义(P＜0.01);用普鲁卡因100μl(0.04mg)肌肉注射24h后,再肌肉、皮下注射pCD-HCV1,抗体水平比直接肌肉、皮下注射同剂量重组体明显增高.该研究结果为寻求HCV-DNA疫苗动物实验佳免疫方法,提供了值得参考的资料.

抗CD95单克隆抗体诱导的活化T细胞凋亡时转录因子nur77的表达

以抗CD95的特异性单克隆抗体(CH-11)诱导人T细胞Jurkat细胞系发生凋亡,Jurkat细胞在发生凋亡过程中出现典型的DNA梯形片段化,以荧光染料(PI)标记的流式细胞学技术对于发生凋亡的细胞进行定量测定,证实发生凋亡的细胞百分比在各个时间点上为6.1%～43.5%之间.以电泳泳动迁移率(EMSA)对于发生凋亡的细胞核中转录因子nur77的表达进行了研究,发现以抗CD95单克隆抗体诱导的活化T细胞发生凋亡时,nur77转录因子表达水平有显著提高.研究结果对了解细胞凋亡时的信号转导与分子生物学机制具有重要意义.

幼鼠内毒素血症脾内单核-巨噬细胞等动态分布

用组织化学和生化方法探讨了幼龄大鼠内毒素血症脾急性非特异性免疫反应.腹腔注入内毒素(i.p. LPS)1h,脾内碱性磷酸酶(ALPase)阳性细胞开始增多,至12h红髓和边缘区内呈现大量的ALP阳性细胞,24～72h这些阳性细胞逐渐减少至正常.电镜下证实这些阳性细胞多数为单核-巨噬细胞和中性粒细胞.腹注LPS 6～12h,脾索和淋巴小结周围呈现较多的一氧化氮合成酶(NOS)阳性细胞.腹注LPS 6～12h生化方法测定脾匀浆NOS和NO的水平显示两者均升高.本研究的结论是:(1)LPS可刺激脾内单核-巨噬细胞和中性粒细胞增多,表明它们有明显的动态分布;(2)脾脏NOS活性反应和NOS及NO含量有严格的时间性;(3)就幼龄大鼠来说,腹注LPS的有效毒性只能维持在24h之内.

脂质体介导IFNγ基因治疗小鼠肝癌的研究

以大肠杆菌β-gal基因为报告基因,优化了3种阳离子脂质体的转染条件,评估了其转染效率.用构建的含腺相关病毒反向末端重复序列(AAV-ITRs)的质粒表达载体,经Dosper介导将小鼠IFNγ基因导入MM45T.Li细胞,体外有效地表达IFNγ.瘤体内注射Dosper-pAI-mIFNγ复合物可明显抑制肿瘤生长,荷瘤小鼠生存期延长.此简便、有效的非病毒转基因方法有望用于肿瘤基因治疗.

大鼠MHC-Ⅰ类基因cDNA的克隆

采用逆转录PCR技术自SD大鼠脾细胞中克隆出全长1125个bp的编码主要组织相容性抗原Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)cDNA,经限制性内切酶图谱分析证实后,定向插入表达载体pBV220,并筛选出带有插入片断的阳性克隆,为研究在原核或真核表达系统中表达及其在抗原识别、免疫应答中的作用奠定了基础.

2型登革病毒核酸疫苗诱导的体液免疫研究

为研究以2型登革病毒NS3基因构建的核酸疫苗能否诱导体液免疫,用表达2型登革病毒NS3的重组真核表达质粒PSV·NS3直接接种Balb/c小鼠.结果发现在接种后2周即可检测到IgM抗体,该抗体在加强接种后滴度显著升高,6周达高水平至少维持2个月;IgG抗体在接种后4周可检测到,8周达高水平至少维持2个月.Western blot证实了接种小鼠血清中有NS3特异性的IgG抗体.这些结果表明我们接种的PSV·NS3能诱导Balb/c小鼠的体液免疫.

慢性肝病患者血清ICAM-1和炎性细胞因子测定

采用双抗体夹心ELISA方法对64例慢性肝炎患者、43例肝硬化患者和28例正常人血清细胞间粘附分子(ICAM-1)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平进行测定.结果:慢性肝炎及肝硬化患者血清ICAM-1及细胞因子水平均明显高于正常(P＜0.01),且病情越重其升高越明显.慢性肝炎重度＞中度＞轻度(P＜0.05～0.01);肝硬化患者高于慢性肝炎患者;失代偿期肝硬化患者高于代偿期肝炎患者(P＜0.05).提示慢性肝病患者血清ICAM-1及炎症相关性细胞因子水平测定可用于判断病情程度及其预后.

ACI血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2表达

测急性脑梗死(ACI)患者血浆中血小板和淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率,为研究上述促、抑凋亡基因对ACI形成机制及预后的影响,寻找超早期防治措施.用流式细胞仪对制备好的血小板和淋巴细胞膜样本进行测定.结果:ACI组血小板、Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率均显著高于对照组,P＜0.05.淋巴细胞膜除bcl-2显著低于对照组外,余均高于健康对照组,P＜0.01.血小板、淋巴细胞膜Fas、APO2.7、bcl-2阳性表达率改变参与ACI形成机制,可将上述指标改变列为超早期诊断和治疗ACI客观指标之一.

丁型肝炎病人肝组织Fas/FasL和HDAg表达

为研究丁型肝炎病人肝组织Fas/FasL和HDAg表达及意义,采用免疫组化单、双标记技术,检测了48例丁型肝炎病人肝组织Fas、FasL和HDAg表达,且以54例乙型肝炎作对照.结果发现,Fas以肝细胞浆表达为主,HDAg以肝细胞核和胞浆表达为主,二抗原表达及分布呈一致性.FasL以浸润淋巴细胞浆或肝细胞核表达为主,与HDAg表达及分布不全一致,3成分在各型肝炎的表达强度有显著性差别意义.提示:Fas/FasL和HDAg均与肝组织炎症活动和病理损害相关,HDV感染可诱导肝细胞表达Fas,CTL通过Fas/FasL途径介导的肝细胞凋亡与HDV致病可能有关.

银屑病与白介素1受体拮抗剂基因多态性

用聚合酶链反应(PCR)技术对38例银屑病患者和85例正常对照组白介素1受体拮抗剂(IL-lra)基因数目可变的串联重复多态性进行了分析,发现银屑病患者中IL1RN2等位基因频率明显高于正常对照组(P＜0.01).如将31例寻常型银屑病分为PASI＜15和PASI≥15两组,则发现前者IL1RN2频率与正常对照相比无显著差异(P＞0.05),而后者有显著差异(P＜0.01);3例脓疱型中的2例,2例关节型及2例红皮病型银屑病患者均携带IL1RN2等位基因.提示IL1RN2可能不直接影响银屑病的易感性,但携带IL1RN2者患病后可能病情更严重.

胸腺因子D对白血病IL-6和TNF的调控作用

探讨胸腺因子D(TFD)对白血病患者白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)的调控作用,以便在白血病治疗中正确使用TFD.在白血病化疗同时,加用TFD 50mg+10%葡萄糖注射液500ml,VD,qd×3mon,检测治疗前后IL-6活性和TNF水平.结果:急性淋巴细胞性白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)的IL-6和TNF均比正常对照组高(P＜0.01).化疗加用TFD治疗后,ALL的IL-6和TNF及ANLL的TNF均比治疗前和化疗组显著降低.TFD加化疗药物联合应用,可能是白血病的有效治疗方法.

抗B-CLL Id x抗CD3双特异性抗体的制备及其特性研究

应用无筛选标记细胞株杂交瘤.杂交瘤细胞直接融合法制备了2株分泌抗慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)Idx抗CD3双特异性抗体(BsAb)的四价体瘤细胞株.采用间接ELISA试验与间接免疫荧光试验证明了该BsAb能分别与B-CLL患者血清及带CD3标记的细胞特异性结合,经细胞结合试验证明该BsAb同时具备与Id及CD3两种抗原结合能力,经酶桥联法证明该BsAb亚类为IgG1×IgG2a,用MTT法证实BsAb能诱导T细胞活化增殖.

一种提高单克隆抗体产量的简易方法

采用一种较常规培养法更简便且能提高产量的制备单克隆抗体的方法,即当杂交瘤细胞生长达90%～95%单层密度时加培养液至瓶颈,加塞置37°C孵箱直立式孵育8～10d后收集上清,用ELISA法测定单抗效价,结果较常规法产量提高8～14倍.

应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗

用miniPerm系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株,获得大量含抗鼠IL-4(IgG1)和IL-5(IgG1和IgG2a)抗体的培养上清;经PM10膜超滤、50%饱和硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白-琼脂糖亲和层析纯化IgG单抗.结果每升杂交瘤细胞培养上清得到大鼠IgG22～36mg;1次可纯化抗体达20mg;经SDS-PAGE及ELISA鉴定,所得到的抗体纯度高、活性保持良好.

鼠抗人Fas单克隆抗体的制备及鉴定

采用Jurkat细胞免疫Balb/c小鼠制备了1株抗人Fas mAb 2A1,它能特异性识别Jurkat、Raji、THP-1细胞膜表面50KD左右的蛋白,并能与SrFas标准蛋白反应,其识别的细胞膜蛋白与单抗特异性抗人Fas PcAb N-18相一致.经Ig类与亚类及型检测试剂盒测定为IgG1、κ型,杂交瘤细胞染色体数目平均为102.

Caspase家族与Fas/APO-1介导凋亡的信号传导

Fas/APO-1介导的细胞凋亡在多细胞生物免疫自稳、免疫耐受、免疫调控、免疫赦免(Privilege)、免疫防御过程中具有极其重要的作用.对Fas/APO-1介导凋亡的信号传导研究表明:一个命名为Caspase的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(亦称IL-1β转化酶相关蛋白酶)家族成员是Fas/APO-1介导凋亡信号传导途径的关键效应分子.本文对Caspase家族成员与Fas死亡受体介导凋亡信号传导的关系加以概述.

TCR-BCR识别抗原机制在分子生态水平的比较

在生命科学所有领域的发展中,都集中到了表现生命活动本质的微观水平和超微观水平.生命活动的本质,也就是生命存在的基础,包括结构和功能,在微观水平以光镜和细胞学常规技术为准;在超微观水平以电镜和分子生物学技术为准.免疫学是生命科学中的一个重要领域;一个学科的发展,常伴随着观念的改变和对它的新认识,免疫学自不例外.