中国组织工程研究杂志
Chinese Journal of Tissue Engineering Research 중국조직공정구여림상강복
- 主管单位： 中华人民共和国卫生部
- 主办单位： 中国康复医学会,《中国组织工程研究与临床康复》杂志社
- 影响因子： 1.38
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 2095-4344
- 国内刊号： 21-1581/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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以内皮细胞基础培养液复合不同方法培养犬脐血间充质干细胞的比较
背景:内皮细胞基础培养液丰要用于培养内皮祖细胞,作者所查用此液培养间充质干细胞的报道较少.目的:对以内皮细胞基础培养液为基础的不同方法培养脐血间充质干细胞的效果比较.设计、时间和单位:对比观察的细胞培养实验,于2005-09/2006-05在上海市新华医院市级重点实验室完成.材料:选取妊娠杂交犬8只,抽取脐血进行干细胞的分离和培养.内皮细胞基础培养液及内皮细胞培养基为美国Clonetics产品.鼠抗CDlla单克隆抗体,鼠抗CDllb单克隆抗体,鼠抗CD29单克隆抗体,鼠抗CD71单克隆抗体均为美国Antibody diagnosdca产品;鼠抗CD34单克隆抗体为美国Lab VisionCorporation产品.方法:收集的脐血干细胞分为A,B,C,D4组.A组用内皮细胞摹础培养液培养:B组用添加有微血管内皮细胞生长培养液的内皮细胞基础培养液在6孔板上培养.C组用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液在纤维连接蛋白包被的6孔板上培养.D组用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液在25cm2细胞培养瓶中培养.主要观察指标:观察各组细胞形态学变化和群体倍增数.应用免疫组化法检测细胞抗原CDlla、CDllb、CD34、CD29及CD71的表达.结果:各组均有成纤维细胞样细胞培养出.A组细胞形态不良,增殖缓慢;B组细胞增殖旺盛:C组细胞克隆不稳定,容易老化;同时出现另一种细胞克隆.D组细胞培养的结果与C组相似.免疫组化法检测抗原显示CD11(-),CD11b(-),CD34(-),CD29(+)及CD71(+).结论:在未经处理的6孔板上,用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液细胞培养液可以培养出生长良好、增殖旺盛的间充质干细胞.应用纤维连接蛋白和25cm2细胞培养瓶培养的效果不佳.
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人肺成纤维母细胞的分化潜能
背景:肺成纤维母细胞在肺组织修复和再生过程中起重要作用,但肺成纤维母细胞的分化特性尚未完全阐明.目的:观察原代培养的人肺成纤维母体细胞外分化特性.设计:以细胞为观察对象,观察性实验.单位:北京世纪坛医院呼吸科和清华大学第一附属医院中心实验室.对象:实验于2006-03/10在清华大学第一附属医院中心实验室完成.取接受一侧肺切除成人肺癌患者远离癌肿的正常组织行肺成纤维母细胞原代培养.肺组织取材经患者同意并签署知情同意书.实验经医院伦理委员会批准.DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液和碱性磷酸酶染色所需萘酚磷酸盐均购自美国Sigma公司.鼠抗人骨桥蛋白抗体购自美国R&B公司.方法:原代培养的人肺成纤维母细胞分别在成骨细胞培养基[含地塞米松1×(10-9-10-5)mol/L,维生素C 50mg/L和β-磷酸甘油10 mmol/L]和成脂肪细胞培养基[含15%马血清,地塞米松1×10-8 mol/L和胰岛素10 mg/L]作用下进行分化诱导.成骨细胞鉴定采用组织化学方法行碱性磷酸酶和钙化斑块染色同时应用Western blotting法测定骨桥蛋白表达.油红染色鉴定脂肪细胞形成.主要观察指标:①在成骨细胞培养基诱导下,人肺成纤维母细胞向成骨细胞分化情况.②在成脂肪细胞培养基诱导下,人肺成纤维母细胞向脂肪细胞分化情况.结果:人肺成纤维母细胞在成骨细胞培养基诱导下,细胞内碱性磷酸酶表达增加,于培养第14天可见大量钙盐沉积,同时骨桥蛋白表达增加.在成脂肪细胞培养基作用第14天,部分细胞由梭形逐渐缩短变成椭圆形,油红染色显示细胞浆内脂肪小滴聚集.结论:人肺成纤维母细胞具有多分化潜能,能够在一定条件下向成骨细胞和脂肪细胞分化,此特性与骨髓间充质干细胞类似.
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腺病毒介导血管内皮生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植梗死心肌的血管再生
背景:骨髓间充质干细胞的存活率与良好的血液供应关系密切,在移植早期其自身所分泌产生的促血管生长因子不足以刺激血管新生而容易导敛移植的细胞死亡.目的:观察骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染对大鼠梗死心肌组织修复重建、血管再牛的影响.设计、时间及地点:随机分组设计的细胞基因于程实验,于2006-01/2007-12在中山大学第二附属医院医学研究中心完成.材料:选取具有相同遗传背景的雄性SD大鼠40只建立急性心肌梗死模型,6～8周龄,体质量250～300g.方法:体外分离、培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞,以BrdU标记骨髓间充质干细胞.腺病毒介导血管内皮生长因子基闪转染骨髓间充质十细胞.将造模后大鼠随机分为4组,每组10只:基凼转染骨髓间充质十细胞组,梗死心肌内注射体外转染腺病毒介导血管内皮牛长因子的骨髓间充质干细胞:骨髓间充质十细胞组,梗死心肌内注射骨髓间充质干细胞:基因转染组,注射腺病毒介导的血管内皮生长因子:对照组,注射无血清IMDN培养液.主要观察指标:移植4周后观察移植细胞分化和新生血管的形成,并通过超声多普勒检测心功能变化.结果:细胞移植4周后,基因转染骨髓间充质十细胞组、骨髓间充质于细胞组移植区移植细胞表现为心肌肌钙蛋白T染色阳性,细胞呈肌样细胞形态,并且两组心功能都较移植前有明显改善,基凶转染骨髓间充质干细胞组改善程度优于骨髓间充质干细胞组.部分BrdU染色阳性的细胞町以分化成为内皮细胞,参与构成了梗死区域新生毛细血管,相对于单纯细胞移植与细胞因了移植,细胞移植结合血管内皮生长因子基因转染促进毛细血管新生更明显.结论:骨髓间充质干细胞移植联合血管内皮生长因子基因转染可以通过促进心肌再生和新生血管的形成来重建缺血心肌,明显改善心功能.
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普伐他汀对人骨髓间充质干细胞增殖分化及分泌功能的影响
背景:针对骨髓干细胞移植治疗心肌梗死及心力衰竭的效果报道不一,如何提高移植细胞在心肌的存活率,并促进其生长,从而增强移植的疗效,是一个值得深入研究且具有重要临床价值的问题.目的:观察普伐他汀在体外对人骨髓间充质干细胞增殖分化及分泌功能的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-0512007-05在上海市疾病预防控制中心毒理实验室完成.材料:人骨髓间充质干细胞由上海第九人民医院组织工程实验室提供.他汀类药物普伐他汀为施贵宝制药公司产品,国药准字H10950315.方法:将冻存细胞解冻,加入含105 U/L,青霉素、100 mg/L链霉素、10%胎牛血清的低糖DMEM,体外扩增培养骨髓间充质干细胞.传至第6代细胞随机分为2组:空白对照组换用低糖DMEM培养基,普伐他汀组分别加入含0.2,1,10,100 μ mol/L普伐他汀的低糖DMEM培养基,作用96 h.MTT.比色法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达,ELISA法测定细胞上清液中血管内皮生长因子含量.主要观察指标:普伐他汀对人骨髓间充质干细胞形态、增殖、表面抗原、血管内皮生长因子分泌的影响.结果:传代后细胞贴壁生长,呈梭形或条形,形态较均一,经100 μ mol/L,普伐他汀作用24 h后细胞形态无明显变化.细胞传代后潜伏期约为48 h,对数增殖期为接种后第4～6天,7 d后进入平台期.与空白对照组比较,0.2,1,10 μ mol/L普伐他汀组均可明显刺激骨髓间充质干细胞增殖(t=3.154～5.837,P＜0.05或0.01).空白对照组CD34呈阴性表达,CD105及CD106阳性细胞百分率分别为32.55%,39.30%;普伐他汀作用2周后细胞表明抗原的表达无明显变化,与空白对照组比较.0.2 μmol/L普伐他汀组血管内皮生长因子浓度无明显变化(t=1.449.P＞0.05);100 umoi/L普伐他汀组血管内皮生长因子浓度明显升高(t=2.325,P＜0.05).结论:普伐他汀不影响人骨髓间充质干细胞的形态与分化,浓度为0.2～10 μ mol/L时可促进细胞增殖,浓度过高则对细胞产生一定毒性而抑制其增殖.此外普伐他汀对骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子具有促进作用.
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人动脉原位干细胞的生物学特性
背景:作者前期工作已经证实,在人体的多种组织中均存在有-类分化潜能可与胚眙干细胞媲美的原始干细胞群体,其表型为CD105+.目的:验证人的动脉是否也存在原位干细胞,并观察其分化潜能.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2004-01/2007-01在河南省人民医院和中国医学科学院组织工程中心完成.材料:实验血管来源于流产胎儿,实验方案经河南省人民医院伦理委员会批准.方法:用MACS磁珠分选CD105+细胞,应用极限稀释法获得单细胞克隆,观察其表型,在特定的诱导培养基中培养,用免疫荧光法和免疫印迹等方法检测其分化.主要观察指标:①干细胞表面抗原鉴定.②血管内皮、平滑肌细胞和脂肪细胞特异性抗原表达.结果:细胞的表型是CD105+Flk1+CD31-α SMA-,可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化.结论:人的动脉中存在着可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和脂肪细胞分化的干细胞.
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诱导时间对体外培养大鼠神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响
背景:近年来通过筛选不同细胞因子的诱导分化作用发现,某些特定的细胞因子配伍可明显诱导中脑神经干细胞体外定向分化成多巴胺能神经元,研究还发现神经干细胞体外诱导分化的多巴胺能神经元可以有效应用于移植治疗帕金森病,为提高其体内移植的疗效,目前迫切需要深入研究神经干细胞诱导分化的生物学特性.目的:探讨大鼠神经干细胞在分化液中诱导不同时间后,其体外分化成多巴胺能神经元的效应.设计:单一样本观察.单位:中山大学附属第一医院神经外科.材料:实验于2007-05/10在中山大学附属第一医院完成,选择清洁级孕14 d的健康SD大鼠6只,体质量350-400 g,由中山大学动物实验中心提供(许可证号码SCXK(粤)2007-0034).实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.方法:①在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.②经传代扩增后,在含白细胞介素1α、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化.③诱导分化2,4,6,8,10 d后,流式细胞仪检测分化细胞中酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.主要观察指标:①大鼠神经干细胞诱导分化后细胞形态的变化.②诱导不同时间的大鼠神经干细胞分化成酪氨酸羟化酶阳性细胞的比值.结果:在诱导分化液中大鼠中脑神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,分化6 d后,多数细胞已生长出一两个长突起及多个短突起.免疫细胞化学显示分化的细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2,4,6,8,10 d的分化细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比例分别为(3.2±0,9)%,(6.8±1.6)%,(16.7±2.6)%.(14.8±1.8)%,(12.2±2.5)%,各组间差异有显著性意义(F=26.449.P＜0.05).结论:诱导时间对大鼠中脑神经干细胞体外分化成多巴胺能神经元的能力存在影响,诱导6 d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比例高.
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白血病抑制因子对转基因SOD1小鼠内源性神经干细胞分化的调控
背景:肌萎缩侧索硬化后运动神经元存在神经变性改变,但其确切机制不明,内源性神经干细胞被认为是未来能有效解决此病的治疗方法之一.目的:探讨白血病抑制因子对肌萎缩侧索硬化转基因小鼠脑干内源性神经干细胞的激活及分化方向的影响.设计、时间及地点:重复观察测量,动物功能学与细胞免疫组化学实验,主要于2006-03/2008-04在天津市第一中心医院完成,部分实验于2004-01/05在澳大利亚墨尔本大学医学院完成.材料:由美国Jackson实验室提供的起源于B6SJL-TgN(SOD1-G93A)、表达突变人类超氧化物歧化酶1基因的转基因小鼠108只,随机均分为正常对照组、肌萎缩侧索硬化组、治疗组.每组动物分别在出生后60.90,120d各取12 Y只用于实验,雌雄各半.方法:各组小鼠均于出生后57d起开始进行运动功能测试,记录小鼠在Rotarod上的停留时间,大测定时问为180 s,每天测试1次,直到实验结束.于出生后90,120 d取材的小鼠,从出生后60 d开始接受药物十预,治疗组腹腔内注射含25μg,Kg白血病抑制囚予的生理盐水,正常对照组与肌萎缩侧索硬化组等鼋注射单纯的生理盐水,1次/d.分别于出生后60,90,120 d终止相应实验,分离小鼠脑干,采用双重免疫荧光组化法标记内源性神经干细胞.主要观察指标:运动功能,内源性神经干细胞的激活,激活后细胞分化方向.结果:出生后60 d,各组动物均能在Rotarod上停留达到大测试时间180 s,脑干均未发现明显的内源性神经干细胞激活.出牛后90.120 d.正常对照组仍能达到Rotarod大测试时间180 s,仍没有明显的内源性神经十细胞激活;肌萎缩侧索硬化组、治疗组小鼠在Rotarod上的停留时间均明降降低,但后者降低程度明显小于前者(P＜0.01);肌萎缩侧索硬化纽、治疗组均出现明显的内源性神经干细胞激活,且后者出现激活的细胞数量明显高于前者(P＜0.05; P＜0.01).出生120 d时与肌萎缩侧索硬化组比较,治疗组内源性神经干细胞分化为星形胶质细胞的比例明显下降(P＜0.01),分化成神经元及少突胶质细胞的比例明显上升(P＜0.01;P＜0.05).结论:白血病抑制因子是一种能提升内源性神经十细胞的激活,调控其朝向神经元及少突胶质细胞分化的神经营养因子.
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密度梯度离心与贴壁法分离培养免骨髓间充质干细胞及其生物学特性观察
背景:获取更大量、更高纯度、有活性的骨髓间充质干细胞是干细胞移植及组织工程研究发展的基础.目的:拟建立一套体外分离培养及大量扩增兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞生物学特性进行观察.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-12/2007-07在山东省烟台市莱阳中心医院骨科试验室完成.材料:清洁级1月龄雌性新西兰大白兔1只.方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合的方式,分离兔骨髓间充质干细胞,应用细胞刮收集呈长梭形的细胞,形成克隆后用胰蛋白酶+EDTA消化.按1∶3传代进行体外扩增培养.主要观察指标:倒置相差显微镜下观察细胞形态特征,免疫细胞化学SABC法鉴定CD34、CD44抗原的表达,观察细胞生长特性,测定细胞活力.结果:原代分离培养的贴肇细胞呈长梭形,漩涡状排列,约14 d达90%以上融合:传代后增殖迅速,细胞为单一的梭形,排列更加有序.所培养的细胞CD44呈阳性表达,而CD34呈阴性.第1～5代细胞培养3～5 d为对数生长期,第7代以后对数增长期延长.第1～5代细胞成活率均＞94%,其中第3.4代成活率高达97%;至第7代细胞活力呈明显下降趋势,细胞成活率仅为78%.结论:应用密度梯度离心结合贴壁法,可成功分离并扩增兔骨髓间充质干细胞,且细胞生长稳定,增殖力强,可作为细胞移植的种子细胞.
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BMI-1干扰基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定
背景:BMI-1的表达对于维持干细胞特别是造血干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞的自我更新能力是不可缺少的.目的:以细菌内同源重组法构建携带BMI-1干扰基因的重组腺病毒载体,制备重组腺病毒pShuttle-H1-AdEasy-1-P1P2/P3P4.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-02/2007-08在江苏大学医学技术研究所完成.材料:限制性内切酶由NewEngland BioLabs提供,腺病毒骨架质粒pAdEasy-1,大肠杆菌BJ5183、Ad293细胞由南京师范大学生科院分子医学生物技术江苏省重点实验室惠赠.方法:采用细菌内同源重组法构建RNA干扰腺病毒载体pShuttle-H1,Pme Ⅰ线性化质粒,通过同源重组腺病毒骨架蛋白pAdeasy-1,得到重组的腺病毒干扰质粒:经Pac Ⅰ线性化后片j脂质体转染方法转染293A细胞,收获腺病毒重组病毒子,以未转入小干扰RNA片段的重组质粒为对照,包装后收集细胞,反复裂解细胞获得腺病毒.主要观察指标:腺病毒质粒重组构建及鉴定情况.结果:经酶切鉴定,已成功构建siRNA的重组腺病毒表达载体pShuttle-H1AdEasy-1-P1/P2P3P4,获得了重组病毒子.结论:利用新型腺病毒载体pAdeasy-1系统口J在短期内制备BMI-1干扰基因的腺病毒表达载体,并制备出重组腺病毒PlP2/P3P4.
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神经干细胞与脑微血管内皮细胞共移植体联合电刺激小脑顶核对局灶性脑缺血大鼠突触素P38表达的影响
背景:突触索P38广泛存在于机体所有神经终末,与神经生长、修复、再生和突触重塑密切相关.目的:实验假设细胞移植及电刺激治疗对突触素P38具有调节作用,拟验证这种作用对局灶性脑缺血大鼠突触素P38表达的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验及细胞观察.于2005-08/2007-02在佳木斯大学神经科学研究所完成.材料:清洁级8周龄Wistar大鼠96只,随机分为神经干细胞组、电刺激+神经干细胞组、共移植体组、电刺激+共移植体组,24只/组.另取新生24 h内Wistar鼠和1～7 d龄Wistar鼠各2只,分别用于神经干细胞、脑微血管内皮细胞的分离培养.方法:将传代的脑微血管内皮细胞按3×107 L-1密度接种在培养瓶中,贴壁后吸出脑微血管内皮细胞培养液,涂一层层粘连蛋白后接种于神经干细胞上,密度为6×108 L-1,待神经干细胞贴壁后吸出培养液,再涂以一层层粘连蛋白,接种3×107 L-1密度的脑微血管内皮细胞,共培养12～24 h,将细胞从瓶壁上依次刮起,适力吹打成1～3个脑微血管内皮细胞与5～18个神经干细胞相互包绕的细胞团,过滤后筛网上的细胞团即为神经干细胞-脑微血管内皮细胞的共移植体.各组大鼠均采用线栓法建立大脑中动脉缺血模型,其中电刺激+神经干细胞组、电刺激+共移植体组大鼠于造模前1d行小脑顶核刺激,电流强度50 μ A,频率100 Hz.时程0.5 ms,连续刺激1h.造模后3 d将培养的神经干细胞、共移植体溶解于磷酸盐缓冲液中,调整浓度为2X 1010 L-1,各组均于右侧纹状体缺血半暗带区移植对应悬液10μL.主要观察指标:移植后3,7,14,60d 免疫组织化学法检测缺血区突触紊 P38 的表达.结果:光学显微镜下突触素 P38 阳性细胞染色呈棕黄色点状或颗粒状沉积,分布较密集,主要分布在神经毡内,部分围绕在神经元胞体周围.移植后各时间点电刺激+神经干细胞组、共移植体组、电刺激+共移植体组脑缺血区突触素 P38 的表达均明显高于神经干细胞组(P<0．05);且电刺激+共移植体组升高幅度显著大于前 2 组 (JP<0．05)，并随移植时间的延长突触素 P38 表达逐渐增加(P<0．05).结论:电刺激小脑项核与共移植体整体干预有助于脑缺血区突触素 P38 的表达,作用优于单纯神经十细胞、单纯共移植体或电刺激+神经干细胞等移植方式.
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特定微环境条件下人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞
背景:目前研究主要是利用大鼠等动物模型来探讨如伺生成脂肪细胞,对于体外分离培养的人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞表型转化的实验报道不多.目的:拟在体外建立人骨髓充质干细胞向脂肪细胞诱导分化的实验方法.设计、时间及地点:细胞形态学体外观察,于2006-12/2007-11在山东省青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:骨髓来源于青岛大学医学院附属医院行自体干细胞移植治疗糖尿病患者的骨髓血,IBMX,地塞米松,吲哚美辛,胰岛素等诱导剂为Sigma公司产品.方法:无菌条件下抽取骨髓血,联合应用密度梯度离心法及贴肇筛选法,以单克隆形式分离培养入骨髓间充质干细胞,当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代.取第3代骨髓间充质干细胞,加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素、1 μmol/L地寒米松、10mg/L胰岛索、O.5mmol/L IBMX、50 μmolL吲哚美辛的低糖DMEM培养基,作为体外特定微环境向脂肪细胞方向诱导分化,以单纯加入低糖DMEM培养基的细胞作为对照组.诱导3周后行油红O染色.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态变化及细胞表面标志鉴定,脂滴形成及脂肪细胞分化率.结果:接种后第2～3天骨髓间充质干细胞开始贴壁,两端有较长突起,呈克隆样生长,形成大小不一的集落;传代后骨髓间充质干细胞呈长梭形,漩涡样牛长;第3代细胞CD44呈阳性,不表达CD34:由克隆扩增出的骨髓间充质干细胞具有高度的同源性.诱导第3周油红O染色示胞核呈蓝色,脂滴呈橙红色,脂肪细胞分化率为(86.0+5.6)%,对照组未见脂滴形成.结论:含有地寒米松、IBMX及胰岛素等诱导剂的体外特定微环境对骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞具有诱导促进作用.
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嗅鞘细胞在脑梗死大鼠中的迁移与神经功能恢复
背景:嗅鞘细胞移植可促进脑梗死大鼠的神经功能恢复,而移植后嗅鞘细胞在脑梗死大鼠中的迁移规律及迁移到不同脑区与该脑区的町耀性上调及神经功能恢复之间的关系如何尚不清楚.目的:观察嗅鞘细胞移植在皮质脑梗死大鼠中的治疗价值及迁移规律.设计、时间及地点:随机对照观察细胞移植实验,于2002-06/2004-01在中山大学第一附属医院神经内科实验室及中山大学动物实验中心完成.材料:2.5月龄SD大鼠用于嗅鞘细胞的分离培养.60～90d龄SD大鼠150只,按双肾双夹方法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠模型.方法:利用筹速贴擘方法纯化大鼠嗅鞘细胞,移植前以Hoechst 33342标记.将符合要求的易卒中型肾血管性高血压大鼠70只制作大脑中动脉梗死模型,随机选取造模后大鼠根据移植部位分组进行嗅鞘细胞移植:皮质梗死灶周围移植、梗死灶对侧皮质移植、两侧同时移植.主要观察指标:移植后第2,6周进行行为、触觉功能检奁观察运动、感觉功能恢复情况荧光显微镜F观察移植细胞体内存活与分布情况.结果:两侧同时移植嗅鞘细胞大鼠运动、感觉功能恢复情况明显好于皮质梗死灶周围移植、梗死灶埘侧皮质移植(P＜0.01),梗死边缘区神经纤维数目、生长相关蛋白43阳性信号值明显多于皮质梗死灶周围移植、梗死灶对侧皮质移植.皮质梗死灶周围移植细胞沿肼胝体分别向梗死灶和梗死对侧皮质区迁徙,梗死灶对侧皮质移精细胞沿胼胝体分别向中线及梗死灶所在的对侧皮质区迁徙,两侧同时移植的细胞沿胼胝体迁徙.且双侧的皮质均可见移植细胞,梗死灶侧明显多于对侧皮质.结论:植入体内的嗅鞘细胞能长期存活,同时可以看到这些细胞并非局限于注射点,可沿胼胝体分别向梗死灶和梗死对侧的皮层区迁徙,并迁移至对侧,促进脑梗死大鼠神经功能恢复的作用,双侧移植效果更加明显.
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异基因大鼠骨髓间充质干细胞对脂多糖刺激活化后小鼠巨噬细胞分泌因子的影响
背景:间充质干细胞可支持造血,抑制或延缓异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,延长异体移植器官的存活时间,具有免疫调节功能,然而其具体的免疫调节机制仍不清楚.目的:探讨SD大鼠骨髓间充质十细胞对脂多糖刺激活化后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞分泌因子的影响.设计、时间及地点:细胞对照观察,体外实验,于2006-12/2007-10在解放军兰州军区总医院血液病研究所完成.材料:清洁级20～22周龄雌性SD大鼠1只用于制备骨髓间充质干细胞,18～20周龄雄性BALB/c小鼠4只用于制备腹腔巨噬细胞,脂多糖为Sigma公司产品.方法:大鼠骨髓间充质十细胞以1×105/孔种植于24孔板,贴壁后作为支持层,再以相同密度加入用巯基乙酸钠腹腔注射刺激法收集的小鼠腹腔巨噬细胞,用终浓度1mg/L的脂多糖刺激活化18 h,收集培养上清待测,此为小鼠腹腔巨噬细胞+脂多糖+大鼠骨髓间充质干细胞组的干预措施.同时设立小鼠腹腔巨噬细胞组、小鼠腹腔巨噬细胞+脂多糖组作为对照.主要观察指标:培养上清中肿瘤坏死冈子α、转化生长因了β、一氧化鲺的含量.结果:与单纯巨噬细胞比较,加入脂多精刺激后培养卜清中肿瘤坏死因子α及一氧化氮含量明显升高(F=10.368,P＜0.05);而当骨髓间充质干细胞存在时,培养上清中肿瘤坏死因子α和一氧化氮含量均明显减少(F=0.017,P＜0.05).各组培养上清中转化生长因子β含鼍基本相似(P＞0.05).结论:实验首次发现SD大鼠骨髓间充质干细胞可抑制脂多糖刺激后BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的活化.
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脐血单个核细胞移植后缺氧缺血性脑损伤新生鼠组织学及远期行为学的改善
背景:脐血单个核细胞移植治疗缺血性脑损伤的研究多集中于成体脑卒中模型,且涉及脑内移植后细胞存活和脑损伤鼠远期疗效的文献甚少.目的:观察脐血单个核细胞侧脑室移植后,缺氧缺血性脑损伤新生鼠远期学习记忆能力、感觉运动功能及脑神经元数目的变化.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2006-12/2007-09在潍坊医学院分子影像学研究中心完成.材料:脐血来源于健康、足月妊娠产妇,由潍坊医学院附属医院产科提供,产妇均签署知情同意书.清洁级健康7 d龄SD新生鼠36只,随机分为正常对照组、脑损伤组、细胞移植组,12只/组.方法:Ficoll法分离培养脐血单个核细胞,移植前3 d体外行BrdU标记.脑损伤组、细胞移植组新牛鼠建立缺氧缺血性脑损伤模犁,造模后24 h,细胞移植组新生鼠于左侧侧脑室注入脐血单个核细胞悬液,共1x105个活细胞.正常对照组不做任何处理.主要观察指标:通过放射性迷宫检测新牛鼠空间学习记忆能力,通过足错误试验、肢体放置试验来检测新牛鼠感觉运动功能.采用免疫荧光法检测脐血单个核细胞脑内移植情况,尼氏染色榆测脑皮质与海马CA1区的神经元数量.结果:36只鼠均进入结果分析.移植后4周与脑损伤组比较,细胞移植组平均觅水时间缩短(P＜0.05),记忆错误次数减少(P＜0.01),两侧足错误次数芹值及两侧爪放置得分的差值均明显降低(Q=6.368,P＜0.01),但仍未达到正常水平.移植后8周鼠脑皮质BrdU阳性细胞广泛存在,细胞移植组脑皮质及海马CA1区神经元数量明显高于脑损伤组(P＜0.05或0.01).结论:脐血单个核细胞侧脑室移植可减轻缺氧缺血性脑损伤,显著改善脑损伤鼠的远期学习记忆及感觉运动功能,具有神经保护作用.
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脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植治疗心肌梗死作用的比较
背景:关于骨髓单个核细胞促使梗死心肌再生存在很大争议,早期研究均认为非常有效,甚至可以分化为心肌细胞,但近的文献却基本否认了这种说法,认为单个核细胞仅可以有限的促进血管生成.目的:比较体外培养的脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植后对促进心肌细胞再生、血管新生及心肌梗死后心功能改善之间的差别.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2004-01/2005-09在解放军总医院心内科实验室与沈阳军区总医院实验室完成.材料:清洁级4月龄雄性新西兰白兔55只,10只用于骨髓单个核细胞标记追踪,剩余兔随机分为脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组、空白对照组,15只,组.方法:各组兔均结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,造模同时取少量腹部脂肪组织分离培养脂肪干细胞,抽取髂骨骨髓分离培养骨髓单个核细胞,用于自体移植.3周后再次开胸,脂肪十细胞组、骨髓单个核细胞组分别于梗死心肌直接注射自体脂肪十细胞和骨髓单个核细胞,空白对照组注射磷酸盐缓冲液.继续培养5周.将专用于骨髓单个核细胞标记追踪的10只兔行DAPI和BrdLJ标记,脂肪干细胞组的移植细胞行BrdU标记.主要观察指标:移植细胞标记情况,移植后心功能变化.苏木精-伊红染色和免疫组织化学检测结果.结果:脂肪十细胞组心肌梗死区可见大量移植细胞存在,可分化为心肌细胞、内皮细胞、参与新血管形成:骨髓单个核细胞组DAPI及BrdU标记后均末于梗死心肌组织发现单个核细胞存在.细胞移植前3组动物心功能基本相似:细胞移植后5周与空白对照组比较,脂肪干细胞组超心动图及左心室压力曲线榆测均显示心功能显著改善(P＜0.05),骨髓单个核细胞组仅等容收缩期左心室压力大上升速率明显改善(p＜0.05).脂肪T细胞组、骨髓单个核细胞组的血管密度均大于空白对照组(p＜0.01,P＜0.05),但前者于心肌梗死中心和边缘均可见大量血管,而后者仅在梗死区边缘血管密度增高.结论:脂肪干细胞移植可以促进心肌再生和新血管形成,进而改善心功能;而骨髓单个核细胞移植仪能促进血管新生,对心功能改善效果有限.
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细胞联合移植修复大鼠脊髓损伤的可行性
背景:嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞均可修复脊髓损伤,两者联合能否发挥出更佳的修复效果还不太清楚.目的:观察嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞联合移植修复脊髓损伤的效果.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-06/2007-10在临沂市人民医院和昆明医学院完成.材料:健康清洁级成年SD大鼠,雌性,体质量220～280 g,分为:正常对照组(n=5)、嗅鞘细胞移植组(n=10)、骨髓间充质干细胞移植组(n=10)、联合细胞移植组(n=10)、手术对照组(n=10).方法:分离大鼠嗅球组织和股骨,分离培养嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞.暴露大鼠脊髓予以尖刀离断制备完伞脊髓损伤动物模型,正常对照组仅打开椎板未行脊髓离断,嗅鞘细胞移植组、骨髓间充质干细胞移植组、联合移植组分别在断端及远近端注射嗅鞘细胞、骨髓间充质干细胞及嗅鞘细胞+骨髓间充质干细胞悬液,采取3点注射,3点的注射深度分别为0.5 mm、1.0 mm和1.5mm.手术埘照组在脊髓离断后仅注射培养基.主要观察指标:将嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞制成细胞悬液后接种培养,并应用P75抗体和BrdU抗体对联合培养的细胞进行免疫荧光鉴定.移植后评定大鼠脊髓功能恢复情况,并观察病理学改变和细胞存活情况.结果:联合培养的细胞部分相互编织成网,部分呈条索状,荧光鉴定双标阳性者为嗅鞘细胞,只发红色荧光而不发绿色荧光者为骨髓间充质干细胞.移植嗅鞘细胞和骨髓间充质干细胞的大鼠脊髓功能均有改善,移植4周后,联合移植组脊髓功能恢复优于细胞移植组.病理学观察显示,手术对照组脊髓结构破坏严重,损伤处可见大量空洞及神经元胞体萎缩,周围存在较多的空洞及组织液化,细胞数目较少,神经纤维排列紊乱;移植鞘细胞及骨髓间充质干细胞后脊髓结构仍破坏严重,但是空洞面积较少,有较多细胞存在,神经纤维排列较为整齐,荧光显微镜下见脊髓损伤处有较多的细胞核发出红色荧光,在脊髓损伤处的远近端也见有较多阳性细胞存在,联合移植组可见两种细胞同时存在,但细胞分布乱,无明显的捧列方向,未见明显的迁徙现象.结论:嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞在体外可以很好的联合培养,修复脊髓损伤,并且联合移植的恢复效果较单一细胞移植更为理想.
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骨髓间充质干细胞移植后在脑梗死大鼠脑内的存活与分化
背景:骨髓间充质干细胞在特定条件下可表达神经元表面标志物,提示其具有分化为神经细胞的潜能.目的:观察骨髓间充质十细胞移植后在脑梗死大鼠脑组织内的存活和分化情况,拟进一步验证骨髓间充质干细胞用于治疗脑梗死的可行性.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2004-12/2007-10在解放军第四军医大学基础部实验室完成.材料:清洁级健康16周龄雄性SD大鼠6只,1只用于制备骨髓间充质干细胞,5只建屯大脑中动脉栓塞模型.方法:取第2代人鼠骨髓间充质干细胞,移植前48 h行BrdU标记.脑梗死大鼠经尾静脉注射1mL细胞悬液,约含有3×106个骨髓间充质干细胞.主要观察指标:骨髓间充质干细胞移植后在脑内的存活情况及脑组织神经元特异性烯醇化晦的表达.结果:细胞移植后28 d,荧光显微镜下可见脑梗死灶(海马)边缘聚集大量BrdUJ阳性细胞,而健侧脑组织中BrdU阳性细胞数量相对较少.脑梗死灶边缘可见少草BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶.结论:骨髓间充质十细胞纤静脉移植入大脑中动脉栓塞大鼠体内后,可存活、移行至脑梗死灶周围,并分化为神经元样细胞.
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微球培养人骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的适宜条件
背景:研究证明细胞的密度、细胞之间的相互作用、培养的体系、细胞因子等对骨髓基质干细胞的分化产生影响.目的:实验拟验证微球培养的人骨髓基质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2006-02/2007-10在青岛市城阳人民医院干细胞实验室完成.材料:骨髓标本取自股骨颈骨折或者髋关节炎症实施髋关节置换手术患者.方法:抽取入骨髓组织,采用密度梯度法分离培养骨髓基质干细胞.当培养的骨髓基质干细胞达到7×≧106个细胞时,将每500 000个细胞离心制成高密度细胞微球,在含有DMEM高糖、胰岛索、转铁蛋白、选择素、丙酮酸、脯氨酸、BSA、地塞米松、抗坏血酸的促软骨细胞分化培养液培养6周.主要观察指标:分析细胞外基质中蛋白聚糖含,并通过组织化学和免疫组织化学方法,以阿尔新蓝染色细胞外基质中的蛋白聚糖, 以胶原蛋白Ⅱ染色显现细胞外基质中的胶原蛋白Ⅱ,对成软骨方向分化的质量进行评价.结果:在微球培养的第3周就可以检测到细胞外基质中的蛋白聚糖,并且随着时间的增长其单位细胞的蛋白聚糖分泌量不断增加.通过阿尔新蓝和胶原蛋白Ⅱ染色,镜下观察在培养的第4周,细胞微球就可以形成细胞外特异性的软骨基质、蛋白多糖和Ⅱ型胶原:6周时,细胞外基质中蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅱ形成更加明显.结论:在无血清软骨细胞分化培养液中,采用高密度微球培养方法可定向诱导骨髓基质干细胞分化为软骨细胞.
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γ-射线诱导Jurkat细胞凋亡过程中催乳素对Bcl-2及Bax表达的调节
背景:国内外文献表明,催乳素可通过调节细胞内凋亡相关蛋白的表达促进免疫细胞增殖并抑制细胞凋亡.目的:拟验证催乳素是否能通过调节T细胞Bax和Bcl-2的表达来影响Jurkat细胞凋亡.设计、时间及地点:以细胞为对象的对比观察实验.于2006-07,2007-05在新乡医学院免疫学实验室完成.材料:人白血病T细胞株Jukat细胞为上海生工产品,人催乳素为sigma公司产品.方法:以10 Gy γ-射线照射Jurkat细胞建立细胞凋亡模型.在射线照射前30 min内,于模犁中分别加入20 μ g/L,300 μ g,L和1 000 μg/L的人催乳素进行干预,同时设不含人催乳素的对照组,以及不进行辐射处理且不加催乳素的正常组.于辐射后的0,24,48 h收集细胞.主要观察指标:以四甲基偶氮唑盐法检测Jurkat细胞的增殖情况;以流式技术检测细胞凋亡情况:以琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat细胞凋亡DNA:以Western Blot法检测Jurkat细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平.结果: ①在γ-射线处理后24和48 h,与对照组比较,300 μg,L和1 000 μ g/L催乳素组和正常组的细胞数量明显增多(P＜0.01).②在细胞经γ-射线处理后48 h,与对照组比较,300 μ g/L和l 000 μ g/L催乳素组和正常组细胞凋亡率显著降低(P＜0.05).③在γ-射线处理后的24和48 h,与对照组比较,各质量浓度催乳素组Bci-2/β-actin灰度比值均明显升高(P＜0.01):300 μg/L和1 000 p g/L催乳素组Bax/β-actin灰度比值明显降低(P＜0.01).结论:在γ-射线诱导的Jurkat细胞凋亡过程中,催乳素可通过提高Bcl-2的表达并下凋Bax的表达,来抑制Jurkat细胞凋亡.
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富血小板血浆对免骨髓间充质干细胞增殖的作用
背景:自体富血小板血浆含有多种生长因子,可以克服外源性生长因子成分单一、来源有限、价格昂贵且存在一定的免疫排斥反应等不足.目的:观察富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖的影响.设计、时间及地点:区组设计,开放实验,于2004-0912005-02在同济医学院医学实验公共实验室完成.材料:2月龄新西兰大耳白兔.方法:采用密度梯度离心结合贴壁筛选及传代方法提取、纯化骨髓间充质干细胞,取较纯和生长状态较好的第3代细胞.采用二次离心法提取兔富血小板血浆.在完全培养基加入体积分数为0.2,0.1.0.05富血小板血浆培养骨髓间充质干细胞,以未加入富血小板血浆的完全培养基为对照.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞生长曲线.②以MTT比色法观察骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力.结果:①加入富血小板血浆干预第2天,骨髓间充质干细胞出现较高的增殖活性,呈快速生长,曲线上升幅度大,细胞倍增时间短,约30 h.以体积分数为0.2富血小板血浆组明显.对照组细胞从第3天起呈快速生长,细胞倍增时间长,约46 h.②富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞时间越长作用越明显,在培养第3天细胞牛长的剂量依赖不明显,培养第6天后较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用显著增强,与对照组比较差异有显著性意义(P＜0.05,P＜0.01).结论:富血小板血浆能明显促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖,并使细胞产生剂量依赖性.
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翼状胬肉纤维组织起源于间充质干细胞的证据
背景:翼状胬肉与阳光、风尘等各种外界因素的慢件刺激和局部慢性炎症反应有关.目前关于翼状胬肉发病机制有多种理论和学说,但均未得到公认.目的:观察翼状胬肉组织病理学特征,探讨多能干细胞在翼状胬肉发生过程中的作用.设计:开放性实验.单位:中山大学中山眼科中心.材料:实验于2006-09/2007-01在中山大学眼科学国家重点实验室完成.218例经临床及病理诊断为翼状胬肉的石蜡标本均来自中山大学中山眼科中心病理室.方法:对手术切除的翼状胬肉标本进行形态学、免疫组织化学和免疫荧光共聚焦显微镜观察.主要观察指标:翼状胬肉形态学变化及CD34、波形纤维蛋白、平滑肌肌动蛋白、S-100在翼状胬肉中的表达.结果:①形态学变化:纤维组织增生及新生血管形成为翼状胬肉的主要病理改变.增生的纤维组织不同区域变化不一,主要呈现两类变化:一为排列致密,类似巩膜纤维组织;另外就是疏松区:仅见一些梭形、多角形、星状具有一些突起的纤维母细胞样的细胞,疏松排列,之间无明显的胶原纤维存在.②CD34免疫组织化学染色显示一些增生活跃的纤维母细胞明显表达CD34,成熟的纤维组织内的纤维细胞CD34则为阴性.波形纤维蛋白免疫组织化学染色在大部分纤维细胞、血管内皮细胞、血管壁及周细胞呈阳性反应.平滑肌肌动蛋白染色显示嗜碱性的小团状、梭形或不规则形的细胞束呈阳性反应,证明为平滑肌,218例中56例显示了平滑肌的存在.S-100染色神经纤维丝及脂肪细胞均呈阳性反应,218例中4_4例有脂肪组织.免疫荧光染色共聚焦显微镜进一步证明增生活跃的细胞为阳性反应,呈现为苹果绿色.结论:翼状胬肉组织中的纤维组织源自于间充质干细胞,并可向平滑肌及脂肪组织分化.
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不同浓度血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的诱导效果比较
背景:血清成分复杂,其中不仅存在促细胞生长因子,同时也存在细胞生长抑制因子,因此合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化至关重要.目的:比较不同浓度的胎牛血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成.材料:纯系清洁级新生24h内的SD大鼠8只,用于制备骨骺干细胞.胎牛血清为Gibco公司产品.方法:免疫磁珠分离纯化FGFR-3阳性的骨骺干细胞,稳定传至第3代后,分别用含1.25%,2.5%,5%,10%胎牛血清的软骨诱导培养基进行干预,诱导14 d.主要观察指标:BrdU-ELISA法检测细胞增殖活性.应用免疫荧光染色和RT-PER法检测细胞Ⅱ型胶原的表达.结果:骨骺干细胞向软骨细胞诱导14d后,10%胎牛血清组细胞增殖活性显著高于1.25%,2.5%,5%胎牛血清组(P＜0.05);10%胎牛血清组Ⅱ型胶原免疫荧光染色阳性程度及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显强于其他3组.结论:含10%胎牛血清的软骨诱导液更有利于骨骺干细胞向软骨细胞方向分化.
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脐血移植发生移植物抗宿主病与T细胞表达CD94的关系
背景:据作者检索脐血移植中有关T细胞表达CD94与移植后发生急,慢性移植物抗宿主病的关系尚无报道.目的:初步探讨T细胞表达CD94在脐血移植免疫耐受中的作用.设计:病例-对照分析.对象:1999-01/2007-06中山大学附属第二医院造血干细胞移植中心行脐血移植的14例患儿,年龄2～9岁,中位年龄6.8岁;接受HLA全相合血缘相关脐血移植患儿9例,接受无关供者脐血移植5例.同时选取体检正常的34例儿童外周血标本作为对照,由中山大学附属二院儿科提供,男18例,女15例,平均年龄4.5岁.方法:抽取正常儿童外周静脉血2 mL,14例患儿均在脐血移植后造血恢复至中性粒细胞绝对数≥0.5×109 L-1时开始采集外周静脉血2 mL,血液样奉均置于EDTA-2Na抗凝管,待测细胞表面抗原.每1～3个月榆测1次,至随访结束.所有样本在6 h内完成标定,均采用双色和三色直接免疫荧光标记法,流式细胞仪检测外周血T细胞表面CD94的表达.主要观察指标:脐血移植后移植物抗宿土病的发生.移植物抗宿主病与外剧血T细胞表面CD94表达的关系.结果:9例接受同胞脐血移植的患儿中,有6例未发生急性移植物抗宿主病,其余3例及接受非血缘相关脐血移植的5例患儿均于移植后6 d-50 d发生急性移植物抗宿丰病,5例患儿发生慢性移植物抗宿主病.与正常对照比较,全部脐血移植患儿CD3+CD4+CD94+T细胞、CD3+CD8+CD94+T细胞的表达均明显升高(P＜0.05).与未发发急性移植物抗宿主病患儿比较,急,慢性移植物抗宿主病患儿CD3+CD4+CD94+T细胞、CD3+CD8+CD94+T细胞的表达均明显升高(P＜0.05).结论:脐血移植后发生急,慢性移植物抗宿主病时T细胞高表达CD94,提示T细胞CD94分子的活化参与了移植物抗宿主病的发生.
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同种异体骨髓间充质干细胞移植对扩张型心肌病模型兔心功能与结构及电生理的影响
背景:近年来通过细胞移植修复扩张型心肌病受损心肌、提高心功能已成为研究热点,但细胞移植后对心脏电生理的影响仍有待观察.目的:观察同种异体体内移植骨髓间充质干细胞移植后对扩张型心肌病模型兔心功能、结构及电生理的影响.设计,时间及地点:随机对照动物实验.于2004-01/2006-05存重庆医科大学附属儿科研究所电牛理实验室完成.材料:选用43只新西兰白兔,体质量3.0～3.5 kg,雌雄不拘.阿霉素为浙江海正医药公司产品,生产批号为050307.SSD-5000超声诊断仪为日本Aloka生产,RM6240多导电生理记录仪为成都仪器厂生产.方法:①摸球法将实验兔随机分为正常组(n=12),细胞移植组(n=13),模型组(n=13),后两组实验兔参考Amoda等的方法采用阿霉素诱导扩张型心肌病模型,每次lmg/kg,每周2次,连续8周.正常组不造模.获取剩余5只实验兔骨髓原液,用贴壁筛选法分离、扩增、纯化骨髓间充质干细胞.②细胞移植组及模型组模型建立成功后3周暴露心脏,将细胞分4点注射到左室前壁,模型组于相同条件下注射等体积DMEM/P12培养基.正常对照组在相同条件下不注射任何药品.主要观察指标:移植后4周,①采用超声诊断仪检测3组大鼠左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率等心功能指标.②应用多导电生理记录仪检测大鼠心肌单相动作电位振幅、0相上升的大速率、单相动作电位时程从激动开始至复极完成50%及90%的时间,记为MAPD50及MAPD90.⑨取细胞移植组移植区心肌及模型组心肌标本,行透射电镜及光镜下组织学观察,同时进行植入细胞肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的免疫荧光检测.结果:纳入实验兔43只,细胞移植组中各有9只因阿霉素急、慢性毒性作用以及手术后感染原因死亡,其余25只均进入结果分析.①心功能检测结果:细胞移植组实验兔左室收缩末期内径较模型组减小,左室射血分数,左室短轴缩短率均高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).②心电生理检测结果:细胞移植组实验兔MAPDS0、MAPD90短于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05).③心肌组织学观察:模型组可见心肌细胞旱广泛的水肿和显著的空泡变性改变,电镜示心肌细胞线粒体肿胀,增生,肌节长短不一,出现异常收缩带,可见局部心肌溶解,细胞移植组移植区组织与之相比,各种受损表现较轻,且移植细胞有肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达.结论:同种异体体内移植骨髓间充质干细胞后在一定程度上可改善扩张型心肌病模型兔心功能,减轻病理损害,并可能抑制心电紊乱的进一步发展.
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肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞体外培养体系的影响
背景:造血干细胞是构筑免疫系统的早的细胞,能分化为多种细胞,其中具有包括免疫应答调控树突状细胞.树突状细胞的诱导培养因前体细胞来源不同,所采用的细胞因子,及佳的细胞因子配伍、应用顺序、实验室培养条件亦不相同,树突状细胞的发育、各种表犁的表达及成熟度也不尽相同.目的:观察肿瘤坏死因子α和白细胞介素4对脐血CD34+造血干细胞来源的树突状细胞诱导培养体系的影响,探寻该培养体系优化方法.设计、时间及地点:观察性实验,于2005-03/11在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成.材料:健康新生儿脐血为南京市八一医院产妇同意捐赠.CD34单克隆抗体一磁珠分离系统为德国Miltenyi Biotec公司产品:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素4和重组人肿瘤坏死因子α为美国PeproTech公司产品.方法:淋巴细胞分离液分离获得脐血单个核细胞,免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞,并用流式细胞术鉴定CD34+造血干细胞纯度:比较GT(GM-CSF+肿瘤坏死因子α)方案和GTI(GM-CSF+肿瘤坏死因子α+自细胞介素4)方案及GTI方案中肿瘤坏死因子α和白细胞介素4不同时段加入对诱导培养产生的树突状细胞成熟的影响;通过激光共聚焦显微镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型及3H-TdR检测树突状细胞激发异体T细胞增殖能力.结果:免疫磁珠阳性分选CD34+造血干细胞纯度町达90%以上.将CD34+造血干细胞按GT方案和GTI方案进行培养.均可诱导产生树突状细胞,CD34的阳性表达率逐渐下降,HLA-DR的表达下降(P＜0.05),树突状细胞的相关分化抗原CD80,CD86,CD83和CDla的表达均相应增加,培养13～15 d的细胞各表型表达较7～9 d,10～12 d充分.但经GT方案诱导的树突状细胞CD14表达较高,cD80,CDB6,CD83,CD1a表达不如经GTI方案诱导的高;而GTI方案中,以肿瘤坏死因子aoh、白细胞介素448 h加入诱导培养的树突状细胞各表型表达相对较佳,其细胞表达CD80,CD86均较其他组高,尤以CD86表达为著,并具有激发异体T细胞增殖能力.结论:CD34+造血干细胞经过合适的培养体系能够诱导分化为功能性树突状细胞,以GM-CSF与肿瘤坏死因子α O h加入、白细胞介素4 48 h加入的GM-CSF+肿瘤坏死因子α+白细胞介素4方案更为可取.
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促红细胞生成素与鼠骨骼肌卫星细胞的增殖及分化
背景:骨骼肌卫星细胞心肌移植过程中,一些重要环节仍无法很好的解决,其中就包括骨骼肌卫星细胞移植后的死亡问题.促红细胞生成素从牛产到临床使用技术都很成熟,具有抗凋亡和减轻炎症反应的作用.目的:探讨促红细胞生成素对鼠骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响,从而为二者联合进行心肌移植的设想提供一些支持依据.设计、时间及地点:细胞生物学行为体外实验,于20O6-07/2007-10在暨南大学医学院中心实验室和深圳市人民医院中心实验室完成.材料:清洁级1～3 d龄SD乳鼠6只,促红细胞生成素为沈阳三生制药公司产品.方法:改良酶消化法分离培养鼠骨骼肌卫星细胞,传至第3代分别加入含0,10,20,40ulmL,促红细胞生成素的DMEM培养基.主要观察指标:倒置显微镜下观察骨骼肌卫星细胞分化能力,MTT法检测细胞活力,流式细胞仪分析细胞周期.结果:未加入促红细胞生成素组培养5 d,局部相邻的骨骼肌卫星细胞可以互相融合成长条状的肌管,随时间延长肌管数量逐渐增多,且能看见肌管跳动;10,20,40 u/mL促红细胞牛成素组均未见肌管形成,骨骼肌卫星细胞大量堆积在一起.与末加入促红细胞生成素组比较,作用48 h,72 h时各浓度促红细胞生成素组骨骼肌卫星细胞活力均明显升高(P＜0.05).随促红细胞生成素浓度的升高,G1期细胞所占百分率逐渐降低,而S+G2/M期细胞所占百分率逐渐升高.结论:促红细胞生成素呈剂量依赖性提高骨骼肌卫星细胞活力、促进骨骼肌卫星细胞增殖,并抑制其向肌管分化.
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骨髓间充质干细胞结合骨形态发生蛋白促进兔椎间关节的融合
背景:研究表明,骨髓间充质干细胞经骨形态发生蛋白诱导可分化为成骨细胞.目的:应用骨髓间充质干细胞、牛骨形态发生蛋白与纤维蛋白胶混合物作为骨移植材料,通过与单纯使用纤维蛋白胶、牛骨形态发生蛋白和骨髓间充质干细胞比较来评价这种移植材料的成骨效果.设计:对比观察实验.单位:广东省第二人民医院,中山大学附属第二医院.材料:实验于2004-01/2006-06在中山大学附属第二医院完成.健康新西兰大白兔由中山大学医学院动物实验中心提供.方法:白兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法在体外培养扩增自体骨髓间充质干细胞.在纤维蛋白胶内加入骨形态发生蛋白制成复合物,再加入骨髓间充质干细胞制成另一种复合物.对12只新西兰大白兔经腹膜外行腰椎间盘切除脊柱融合术.每只动物取L3-6个椎间隙随机接受4种移植方法中的3种:骨髓间充质干细胞+骨形态发牛蛋白+纤维蛋白胶、骨髓间充质干细胞+纤维蛋白胶、骨形态发牛蛋白+纤维蛋白胶、纤维蛋白胶.术后3月利用放射学和组织学方法观察分析脊柱融合情况.主要观察指标:兔脊柱椎间隙骨痂形成情况.结果:①术后12周时,骨髓间充质干细胞+骨形态发生蛋白+纤维蛋白胶组椎间隙骨痂形成明显较其它组多,组织学上有连续的骨痂形成.骨髓间充质干细胞+纤维蛋白胶、骨形态发生蛋白+纤维蛋白胶组可见前纵韧带后方有编织骨形成,骨少,不连续.纤维蛋白胶组见纤维组织增生及少量成骨细胞,未见新骨形成.各组均未见纤维蛋白胶残留,椎间盘中有少量椎间盘髓核残余、中间有少量软骨组织形成.②12周时X射线检查显示,各组兔均未造成椎体后缘增生,无椎管狭窄.骨髓间充质干细胞+纤维蛋白胶组节段活动度与骨形态发生蛋白+纤维蛋白胶组、纤维蛋白胶组差异显著(P＜0.05);各组间椎体后缘高度丢失差异不显著.结论:自体骨髓间充质干细胞、纤维蛋白胶和骨形态发性蛋白复合体可在椎间关节形成骨性骨痂,融合效果好,组织学方面评价也较其他方法好.
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三七总皂苷对脑损伤新生鼠海马神经干细胞钙离子和膜电位的调节
背景:钙离子参与神经信号的传递和神经递质的释放,脑海马神经干细胞的增殖过程必然和钙离子关系紧密,同时这一过程也反应在膜电位的变化上.目的:探讨中药三七总皂苷对脑损伤新牛鼠海马神经干细胞Ca2+和膜电位的影响.设计、时间及地点:离子水平,体外细胞学电生理观察,于2007-03/05在北京中医药大学细胞培养室完成.材料:清洁级新牛24 h内Wistar鼠16只.三七总皂苷为内蒙古康源药业有限公司产品,批号ZZ-5802-内卫药准字(1999)1787号,规格350g/10L.钙离子荧光探针Fluo3-AM、亲脂性阴离子荧光探针DiBAC4(3)为Sigma产品.方法:取新生鼠脑海马组织,采用无血清培养法分离扩增神经干细胞.设立3组:正常组细胞加入含糖Earle氏液,并始终在正常气体条件下培养:模型组、用药组细胞采用糖氧剥离法体外模拟脑缺血再灌注损伤,即加入无糖Earle氏液,将培养板放入缺氧罐内模拟脑缺血状态.用药组在换液时及脑缺血4h后分别加入17.5 mg/L三七总皂苷1.75 μ g.细胞内钙离子和膜电位分别用Fluo3-AM、DiBAC4(3)荧光探针进行标记.主要观察指标:神经干细胞Ca2+、膜电位荧光值的变化.结果:缺血冉灌注后30 min～1 h,正常组神经干细胞内Ca2+浓度呈上升趋势,至再灌注2 h胞内Ca2+浓度达到高峰,再灌注3 h胞内Ca2+浓度开始降低:膜电位变化与Ca2+浓度变化完全相反.与正常组比较,模型组再灌注后30 min,1 h,2 h,3 h神经干细胞内Ca2+浓度均明显升高(P＜0.05～0.001),膜电位均明显下降(P＜0.001);经三七总皂苷处理町抑制Ca2+浓度升高(P＜0.05～0.01),并抑制膜电位下降(P＜0.05～0.001).结论:防止细胞内钙超载和细胞膜电位降低可能是三七总电苷保护损伤脑海马神经干细胞的作用机制之一.
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鼠胚成纤维细胞的培养条件及滋养层制备
背景:鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理或Y射线照射阻断其有丝分裂后,铺层的细胞可保持活力但不增殖,并能够在生长过程中产生促进胚胎十细胞生长的因子和抑制胚胎干细胞分化的因子,但其生命期有限.目的:探讨分离小鼠胚胎成纤维细胞的适胚龄与培养条件,以及用其制备细胞饲养层的效果.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-11/2006-07在广东省计划生育专科医院实验室完成.材料:清洁级昆明系孕7.5,10.5,13.5,16.5,19.5 d雌鼠各5只.方法:无菌取上述各孕龄小鼠胚胎分离鼠胚成纤维细胞,调整细胞浓度为1×107L-1、1×109L-1 1×1011 L-1,胰酶消化传代.当胚胎成纤维细胞生长并相互接触时,加入丝裂霉素C作用2-4 h,用无钙无镁PBS配制的胰蛋白酶液消化2～5 min,终止后用吸管吹打皿底,使细胞充分分离,以含10%胎牛血清的DMEM液调整细胞浓度为5×108 L-1,将该悬液移入明胶处理的培养皿内常规培养,制备鼠胚成纤维细胞饲养层.主要观察指标:胎龄、细胞浓度、传代次数对鼠胚成纤维细胞生长增殖的影响.不同胎龄鼠胚成纤维细胞饲养层制备效果.结果:7.5～19.5 d鼠胚均可分离出成纤维细胞,但7.5 d.10.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞数少,寿命短,且混有大量杂细胞:13.5d鼠胚分离所得成纤维细胞数量多,增殖快,所含杂细胞少:16.5～19.5 d鼠胚分离所得成纤维细胞生长状态不良,增殖缓慢,杂细胞较多.同等条件下与1x107 L-1、1×1011 L-1浓度比较,1×109 L-1浓度的鼠胚成纤维细胞生长状况良好,铺层时间适中,细胞寿命长(P＜0.05).以13.5 d鼠胚成纤维细胞经初代培养后传4代,成功建立了成纤维细胞株,相同条件下1～代细胞形态,体积、生长状况无明显差别.7.5～19.5 d鼠胚成纤维细胞制备的饲养层,铺层时间基本相似(P＜0.05),细胞寿命均可维持一二周.结论:分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的适胎龄及细胞浓度分别为13.5d与1×109 L-1,4代以内传代次数不影响鼠胚成纤维细胞的生长增殖,且不同胎龄所制备的饲养层细胞寿命无差别.
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皮肤干细胞的定位
应用计算机检索Pubmed数据库1990～2008年、中文期刊全文数据库1998-2008年与皮肤干细胞定位相关的文献,44篇文献资料分析结果显示,毛囊bulge区细胞具有高度增殖潜能,为标记滞留细胞,具有多向分化潜能,不表达分化细胞特异性标志,表达十细胞标志,为目前公认的表皮干细胞的定居处.毛囊真皮鞘包含具有可塑性的干细胞,认为是真皮干细胞的定居处.毛囊真皮乳头内含有具一定增殖分化能力的前体细胞,与真皮鞘相互作用,能够诱导毛囊形成,目前观点认为,真皮乳头内前体细胞移行自真皮鞘干细胞,为其活化的子代细胞.毛囊问皮肤与无毛区皮肤是否存在皮肤干细胞尚存争论,部分实验表明,毛囊间表皮基底层亦有表皮干细胞的存在.
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干细胞移植治疗脑缺血的研究现状
脑缺血性疾病致死、致残率高,可供选择的治疗方法少,效果欠佳.神经细胞替代治疗能够重建神经传导环路,恢复部分神经功能,机制可能在于:移植到宿主体内的十细胞能够分化成为功能性的神经胶质细胞、神经元,替代已死亡的神经元的部分功能:激活内源件神经干细胞;分泌细胞因子,改善缺血坏死区的局部微环境如炎症、组织坏死及神经胶质瘢痕等.动物实验研究中治疗脑缺血的干细胞来源主要有人胚胎干细胞、人脐带血细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质细胞等.目前细胞替代疗法尚处于研究的初级阶段,具体的机制仍不十分明确.关键问题在于两方面:移植细胞在缺血的环境下如何存活?移植细胞如何替代、挽救已损失的各种类型的神经细胞?
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牙髓干细胞的研究与进展
综合分析牙髓干细胞的研究现状及发展方向,以期更好地分离鉴定牙髓干细胞,提高牙髓干细胞的体外增殖活性.通过对入选文献进行分析整理,将牙髓干细胞从干细胞理论、牙髓干细胞概念、牙髓干细胞生物学特性及牙髓干细胞培养4方面进行分析.虽然日前对牙髓干细胞的生物学特性、培养方法及应用前景已有一定了解,但牙髓干细胞的体外培养扩增、鉴定和分子机制等问题尚未完全清楚,这对牙髓干细胞的应用起到决定性作用.牙髓组织取材容易,利用牙髓干细胞研究牙齿器官发育、牙髓损伤修复的分子机制,以期终能寻找更好地解决牙髓组织损伤修复的治疗方法.
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干细胞的衰老学说
文章从造血干细胞的自我更新和分化的过程中.阐明干细胞质和量的衰老,端粒缩减、氧化应激均加速干细胞的衰老,组蛋白的编码和转录子的激活可导致DNA或蛋白质的损伤.在干细胞衰老中,异染色质结构和基因转录的异常是干细胞衰老的重要调节机制.如果十细胞的衰老不是发生在基因水平上,那么则是发生在转录水平之中.因此在干细胞的造血中,众多的转录错误导致细胞周期衰老,是异染色质扩展的恶果.在正常的情况下,上述机制通常是不会发生的.如果仅仅是异染色质的错位,则不是干细胞基因表达的结果,在干细胞自我更新中充分证明,异染色质的改变导致了组蛋白的改变.
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单倍型造血干细胞移植的新进展及其临床结果
目前,国内外尚无单倍型相合未去T细胞移植成熟的方案,对于难治和高危白血病患者,化疗预后是很差的,应不失时机进行异基因造血干细胞移植,如果能够跨越人类主要组织相容性抗原的限制,用人类主要组织相容性抗原半相合的亲属作为造血干细胞移植的供体,就可以彻底解决干细胞来源问题.采用诱导免疫耐受新方法可提高预防移植物抗宿主病疗效.国外通过使用抗胸腺细胞球蛋白、氟达拉滨、甲强龙和伞身照射使人类土要组织相容性抗原单倍型骨髓移植排斥率由40%降到0-5%,国内基本采用体外不去T和诱导免疫耐受的移植方式,结果优于国外报告,显著的疗效与国内未进行T细胞清除相关.
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外周血造血干细胞的采集及移植效果分析
对2002-05/2007-09河南省红十字血液中心收治的219例行外周血造血干细胞采集术的血液病、自身免疫性疾病、实体瘤患者进行回顾性分析.采集前应用改良Bu/Cy预处理方案,加小剂量粒细胞集落刺激因子对患者进行外周血造血干细胞动员,动员至第5天,白细胞突然升高、单个核细胞数达50%～80%时进行采集,选择CS-3000plus 血细胞分离机设定伞血流速为50 mL/min,终处理血量10 000～15 000 mL,界面探测值根据患者单个核细胞的数目,对照外周血造血十细胞采集程序中的参数设定.195例自身采集患者其粒细胞恢复至1.0X 109 L-1的中位时问为10 d,血小板恢复至＞50X 109 L-1的中位时间为29d,未见移植细胞功能迟缓出现.24例异体采集患者亦全部成功.随访3,6,12个月无死亡病例,随访18个月时2例死亡,219例患者全部达到预期生存的治疗效果.
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嗅鞘细胞移植治疗帕金森叠加综合征1例
患者,女,23岁,由北京西山医院神经疾病研究治疗中心诊断为帕金森叠加综合征.采用立体定向方法,将嗅鞘细胞移植到患者双额放射冠部位.患者术后当天诉右手可以握拳,语言较术前清晰,四肢肌张力较术前减低,第2天双侧下肢肌张力较术前减低,第3天语言较术前明显清晰,面部表情较术前丰富.国际统一的帕金森病评定量表评分显示,自嗅鞘细胞移植后4 h开始,患者神经功能逐渐有部分改善,术后第14天总分由术前109分降至9r7分:其中言语表达2→1分,面部表情4→3分,强直项中:颈3→2右上肢3→2左上肢3→2右下肢3→1左下肢3→2,手指拍打实验:右手4→3左手4→3,手运动:右4→3左4→3.患者住院期间未发现任何不良事件.
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以反相高效液相色谱法测定生物组织及细胞中的能量代谢变化
文章综合分析了近年来采用反相高效液相色谱检测技术测定牛物组织及细胞中主要能量物质的研究进展,且从样品的预处理、流动相及色谱条件的确定等方面进行了阐述.利用反相高效液相色谱技术可同时快速、准确测定多种生物能量物质,方法简便、快捷.反相高效液相色谱检测技术要求仪器各部件件能稳定;分离色谱柱需具较高的柱效,良好的分离度和洗脱曲线:取材部位要固定.以保证结果的可比性:标本须低温下提取,并尽快将样品移入高氯酸溶液中:匀浆时要求细胞完全破碎,充分抽提细胞中的ATP,低温离心,保证测定结果的准确性.反相高效液相色谱作为一种高效分离技术,将越来越广泛地应用于复杂能量物质的分离与定分析中.
