高内涵药物筛选方法的研究及应用

高通量药物筛选(high-throughput screening,HTS)是20世纪80年代中期产生的为寻找先导物针对大量样品进行药理活性评价分析的一种技术手段,在创新药物的研究和开发中发挥了重要作用.本室于1998年在国内率先将其用于创新药物的研究,已发现一批具有潜在研究价值的化合物 [1,2].近年来在药物发现领域又出现了一个新概念--高内涵药物筛选(high-content screening,HCS).本文就高内涵药物筛选目前的研究和应用情况作一讨论.

药物研究与开发中的高通量结晶技术

1 前言药物固体剂型(片剂、颗粒剂,胶囊等)使用方便,贮存稳定,是市场上主要剂型.一种活性药物组分(active pharmaceutical ingredients, APIs)可能存在多种固体形式,包括多晶型、溶剂化物、水合物、共晶、无定形固体和盐(可能形成水合物、溶剂化物、多晶型、共晶和无定形固体),每种形式都呈现独特的物理化学性质,显著影响其溶解度、溶出速率、生物利用度、稳定性、可纯化性和加工性等药物的性能.所以,APIs固体形态的研究是药物开发过程的一个重要方面.一种药物的多种固体形态的发现不仅能为确定佳药物固体形式提供更大的选择空间,而且还能获得知识产权保护.

羟苯氨酮保护大鼠心脏对抗心肌缺血-再灌注损伤

目的研究强心扩血管新药羟苯氨酮(oxyphenamone)对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用.方法对离体或在体大鼠心脏,阻断冠脉前降支10 min后行再灌注15 min(离体)或30 min(在体),形成心肌缺血-再灌注损伤模型,从心电图、心肌酶学与心肌超微结构等方面观察药效.结果羟苯氨酮(离体心脏灌流1-10 μmol·L -1,或静脉注射0.1-1.0 mg·kg -1)剂量依赖性地明显减少再灌注时的心律失常,对抗损伤所致心肌CPK,LDH与MDA的变化,减轻心肌超微结构损伤.结论羟苯氨酮明显保护离体和在体大鼠心肌对抗冠脉阻断所致缺血-再灌注损伤.

内皮依赖性超极化因子在剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应中的作用

目的研究内皮依赖性超极化因子(EDHF)在剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应中的作用及机制.方法测定不同流量下的血管内径及各种内皮依赖性舒张因子抑制剂、钾通道抑制剂、细胞色素P450单氧化酶抑制剂作用下的血管内径.结果剪切应力在大鼠肠系膜微动脉引起的舒张反应是内皮依赖性的,且在大的肠系膜动脉明显大于小阻力型肠系膜动脉.EDHF在上述两种动脉的内皮依赖性舒张反应中作用均明显大于NO,起主要作用.剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应不受SKF525A的抑制,ChTx加apamin明显抑制了此舒张反应,TBA则几乎完全抑制此舒张反应.结论在剪切应力引起的内皮依赖性舒张反应中EDHF起主要作用,钾通道特别是KCa通道的激活为主要机制.

抗炎药物对HEK293细胞NF-κB活化的调节作用

目的探讨不同作用机制的抗炎药物对内源性和TNFα诱导的NF-κB的调节作用.方法利用荧光素酶报告基因测定法检测细胞内NF-κB活化水平,MTT法测定细胞增殖,PI染色-流式细胞仪测定细胞凋亡.结果一定浓度的美洛昔康和地塞米松能够明显降低HEK293细胞内源性和10 ng·mL -1 TNFα诱导的NF-κB活化,1×10 -9 mol·L -1氢化考的松分别明显增加和降低这两种活化,而吲哚美辛对内源性活化无明显影响.4种药物对HEK293细胞增殖均无明显作用.地塞米松单独或联合TNFα、吲哚美辛联合TNFα能够引起细胞凋亡.结论不同类型的抗炎药物对内源性和TNFα诱导的NF-κB活化影响不同.提示NF-κB活化调节可能成为药物作用机理研究的有效靶点之一.

盐酸苯环壬酯对大电休克发作及戊四氮惊厥模型的抗惊作用

目的评价盐酸苯环壬酯抗癫痫疗效,探讨其抗癫痫作用机制.方法建立不同癫痫发作模型,评价盐酸苯环壬酯等药物抗癫痫疗效;观察盐酸苯环壬酯等药物对致死剂量NMDA中毒小鼠、NMDA诱导的原代培养大鼠海马神经细胞损伤及NMDA诱发电流的影响.结果盐酸苯环壬酯在不同癫痫发作模型上均具明显抗惊作用;并可显著对抗致死剂量NMDA中毒,浓度依赖性抑制NMDA诱导原代培养大鼠海马神经细胞损伤及NMDA诱发电流.结论盐酸苯环壬酯在经典癫痫模型上均具显著抗惊作用,其作用机制可能与其对NMDA受体的拮抗作用有关.

双(α-呋喃甲酸)氧钒对糖尿病大鼠血糖的调节作用

目的研究双(α-呋喃甲酸)氧钒(VO-FA)对正常大鼠及链脲佐霉素(STZ)性糖尿病大鼠的降糖作用.方法以STZ诱导大鼠糖尿病模型.观察VO-FA灌胃给药后,对血糖、糖化血红蛋白、糖原和血清胰岛素等的影响.结果 VO-FA ig两周后,剂量依赖性地降低STZ性糖尿病动物的血糖水平,但对正常动物的血糖无影响.VO-FA 56.8 mg·kg -1可降低正常动物血清胰岛素水平,加倍剂量尚能降低STZ性糖尿病大鼠的血清胰岛素水平.此外,VO-FA 能降低糖尿病大鼠的糖化血红蛋白,明显改善糖耐量,增加肌糖原和肝糖原的含量,并呈现出量效关系,但对正常动物则没有影响.结论 VO-FA可以改善糖尿病动物的糖代谢,而不影响正常动物的血糖水平.

宽叶金粟兰化学成分的研究

目的研究宽叶金粟兰根的化学成分.方法利用多种柱色谱方法进行分离纯化,根据光谱数据和理化性质进行结构鉴定.结果从宽叶金粟兰根中分离鉴定了8个化合物,分别是:curcolonol (I),zedoarofuran (II),shizukanolide E (III),异秦皮啶-7-O-葡糖苷(IV),伞形花内酯苷(V),异秦皮啶-3-β-D-芹菜糖(1→3)-β-D-葡糖苷(VI),β-谷甾醇(VII),胡萝卜苷(VIII).结论异秦皮啶-7-O-β-D-芹菜糖(1→3)-β-D-葡糖苷(VI)为新化合物,命名为宽叶金粟兰苷,化合物I和II为首次从该属植物中分离得到.

鬼臼毒素人工抗原的合成与鉴定

目的合成和鉴定鬼臼毒素人工抗原,以获取具有特异性和高度亲和性的鬼臼毒素多克隆抗体.方法通过酯化反应合成半抗原鬼臼毒素半琥珀酰酯;利用活泼酯法和混合酸酐法偶联成免疫和包被所需的人工抗原;按常规免疫法,从免疫的兔血清中获取高效的抗鬼臼毒素抗体.结果质谱、核磁共振和红外分析表明两种不同方法均成功地合成了半抗原鬼臼毒素半琥珀酰酯.人工抗原的偶联比因载体蛋白和合成方法的不同而有所不同,Hapten-BSA1为88.6,Hapten-BSA2为40.3,Hapten-OVA1为17.8和Hapten-OVA2为54.2.利用兔M4440产生的抗血清建立的ELISA方法对鬼臼毒素的低检测浓度为0.12 μg·mL -1,半数抑制浓度为2.21 μg·mL -1.结论成功地合成了鬼臼毒素人工抗原,并获得了抗鬼臼毒素抗体,为鬼臼毒素免疫分析方法的进一步研究提供了条件.

侧茎橐吾化学成分的研究

目的侧茎橐吾(Ligularia pleurocaulis)为菊科橐吾属植物,其根和根茎入药,有止咳化痰、活血化瘀等功效,为中药"紫菀"(中国药典2000年版收载为Aster tataricus L.f.的根及根茎)的代用品之一,称为"山紫菀".有关侧茎橐吾的化学成分研究尚未见报道,因此,本文对侧茎橐吾的根及根茎的化学成分进行了研究.方法侧茎橐吾的根和根茎用甲醇提取,硅胶柱色谱和重结晶等方法进行分离纯化.根据化合物的理化性质和光谱数据进行结构鉴定.结果分离得到了12个化合物,即6-angeloyloxy-furanoligularenone (1),2-oxo-3-hydroxy-eremophila-1(10),3,7(11),8-tetraen-8,12-olide (2),顺芷酸(3),齐墩果酸(4),羽扇豆醇(5),β-谷甾醇(6),胡萝卜苷(7),咖啡酸(8),大黄素(9),7-甲氧基香豆素(10),阿魏酸(11)和4-羟基-2,5-二甲氧基-苯甲醛(12).结论化合物1为新的eremophilane型倍半萜,化合物2为新的天然产物.所有化合物均为首次从本植物中得到.

苦马豆根和茎中一个新黄酮苷

目的研究苦马豆根和茎的化学成分.方法采用反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20色谱进行化合物的分离,根据波谱数据鉴定化合物结构.结果从95%乙醇提取物正丁醇萃取部分得到8个化合物,鉴定为:异鼠李素-3-O-[6″-(3-羟基-3-甲基戊二酸单酯)-β-D-吡喃葡糖苷](I)、槲皮苷(II)、正丁基-β-D-吡喃果糖苷(III)、尼克酸(IV)、丁二酸(V)、赤藓醇(VI)、D-甘露醇(VII)和尿嘧啶核苷(VIII).结论化合物I为新化合物,化合物I-VI均为首次从本属植物中得到.

蝉翼藤根中的一个新二苯酮

目的对蝉翼藤(Securidaca inappendiculata Hassk.)根的二苯酮成分进行分离和结构鉴定.方法通过硅胶和凝胶反复柱色谱分离得到二苯酮类化合物;利用多种波谱技术鉴定其化学结构.结果分离鉴定了2个二苯酮化合物,其结构分别为2-甲氧基-3,4-亚甲二氧基-二苯酮(I),4-羟基-2,6-二甲氧基-二苯酮(II).结论化合物I为新化合物,命名为蝉翼藤二苯酮B;化合物II为首次自该属植物中分离得到.

灯盏花素及其β-环糊精包合物在大鼠体内的药代动力学

目的建立测定大鼠血浆中灯盏乙素浓度的反相高效液相色谱法,研究灯盏花素及其β-环糊精包合物(灯盏花素-β-CD)大鼠灌胃后体内药代动力学行为.方法以甲醇-水-醋酸盐缓冲液为流动相,Shim-pack C18为固定相;12只大鼠随机均分为2组,分别灌胃灯盏花素及其包合物后,检测血浆药物浓度.药时数据采用3P97药代计算程序处理.结果线性范围10-400 ng·mL -1,方法回收率95.32%-98.81%;灯盏花素和包合物的Cmax分别为(154±18) ng·mL -1和(328±31) ng·mL -1;AUC0-12h分别为(710±126) ng·h·mL -1和(1 093±200)ng·h·mL -1,经t检验两者有极显著性差异(P<0.01).结论该法准确、灵敏,适用于灯盏乙素血浆浓度的测定;制备的灯盏花素包合物与灯盏花素相比吸收显著增加.

冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠体内的组织分布及兔体内的药代动力学

目的考察冬凌草甲素固态类脂纳米粒在动物体内的组织分布及药代动力学特性.方法建立生物样品中冬凌草甲素的HPLC测定法,比较冬凌草甲素普通注射液和固态类脂纳米粒注射液的体内分布特点与药代动力学参数.结果冬凌草甲素固态类脂纳米粒在肝、脾、肺、心及肾中的相对摄取率分别为4.25%,3.44%,1.19%,0.52%和0.60%.静脉注射后的药-时曲线表明体内过程符合三室模型,其各相半衰期分别为T1/2π=0.087 h,T1/2α=1.65 h,T1/2β=32.36 h,中心分布容积VC=0.66 mL·kg -1.结论冬凌草甲素固态类脂纳米粒能够增强药物的肝脾靶向性,提高药物生物利用度,并在一定程度上延长药物在动物体内的循环时间.固态类脂纳米粒可能成为冬凌草甲素的一种新型药物载体.

心肌细胞靶向脂质体的制备及体外靶向性研究

目的制备心肌细胞靶向脂质体,并对其体外心肌细胞靶向性进行研究.方法选用与β1-受体阻滞剂艾司洛尔结构类似的亲脂性化合物PAC修饰脂质体(PAC-L);将荧光标记的普通脂质体(Plain-L)与PAC-L加入体外培养的心肌细胞中,在特定实验条件下共同培养一定时间后,用荧光分光光度计测定心肌细胞摄取荧光脂质体的量.结果 PAC-L与心肌细胞有较强的亲和力,且心肌细胞对PAC-L的摄取显著高于非心肌细胞(P<0.001);常氧条件下2 h心肌细胞对PAC-L的摄取较Plain-L高约2.9倍,而在缺氧条件下则高出5.2倍;心肌细胞对Plain-L的摄取约11%是以内吞方式摄取的,而对PAC-L则约有56%是以内吞方式进行的.结论本文制备的PAC-L具有较强的心肌细胞特异靶向性,有可能成为一种有效的缺血心肌靶向性药物载体.

水溶性添加剂对聚乳酸-聚乙烯醇酸共聚物基质释药动力学的影响

目的选择不同亲水性及空间构型的添加剂,研究其对聚乳酸-聚乙烯醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid, PLGA)药物释放动力学的影响,为心血管药物局部用药控释制剂的研究提供理论依据.方法用抗细胞增生药物2-氨基色酮(U-86)作为代表性药物,用溶剂浇铸和压膜结合的方法制备药物/PLGA/添加剂双层膜,在37 ℃磷酸缓冲液中测定体外药物释放并用扫描电镜观察表面形态.结果水溶性添加剂明显地提高了U-86的释放率,并转变为近似的单阶段模式.药物释放速率与基质的失重速率非常吻合.水溶性添加剂的基质在水中形成高度多孔的结构.结论添加剂的水溶性、分子量大小及空间构型等对于聚合物基质的孔隙结构具有决定性作用,而这些孔隙结构的特征又影响着药物释放机制以及释放动力学模式.

口服制川乌提取物后大鼠体内乌头类生物碱的组织分布

目的建立HPLC法测定口服制川乌提取物后大鼠体内乌头类生物碱的方法.方法用Waters 2690@996 PAD系统,Halsil 100 C18柱(250 mm×4.6 mm ID, 5 μm),水-甲醇-二乙胺(75∶ 25∶ 0.1)为流动相,流速0.9 mL·min -1,检测波长240 nm.结果乌头碱在心脏、脾脏、肺脏、肾脏的线性范围:0.4-100 μg·mL -1,r分别为0.997 2,0.998 6,0.999 3,0.999 4;在肝脏的线性范围:2-200 μg·mL -1,r为0.999 0.次乌头碱在心、肝、脾、肺、肾、脑和脊髓的线性范围:5-100 μg·mL -1,r分别为0.999 4,0.999 7,0.999 8,0.998 4,0.999 8,0.999 8和0.999 7.乌头碱及次乌头碱的检测限(S/N=3)为0.4 μg·mL -1.各组织中的回收率:乌头碱为88.7%-102.2%,次乌头碱为86.5%-101.3%.结论本法为确证乌头类生物碱的中毒提供了科学有效的依据.

The validation of a simple, sensitive and specific agar diffusion bioassay, applying cylinder-plate method, for the determination of the antibiotic azithromycin in ophthalmic solutions is described. Using a strain of Bacillus subtilis ATCC 9372 as the test organism, azithromycin at concentrations ranging from 50.0 to 200.0 μg·mL -1 could be measured in 1.666 7 mg·mL -1 ophthalmic solutions. A prospective validation of the method showed that the method was linear (r=0.999 9) and precise (RSD=0.70) and accurate (it measured the added quantities). The results obtained by bioassay method could be statistically calculated by linear parallel model and by means of regression analysis and verified using analysis of variance (ANOVA). We conclude that the microbiological assay is satisfactory for quantification of azithromycin in ophthalmic solutions.

HPLC-ELSD法测定浙贝母中主要生物碱的含量

目的利用HPLC-ELSD测定贝母类药材中的贝母素甲和贝母素乙.方法 XTerra RP18色谱柱(150 mm×3.9 mm ID, 5 μm),流动相为乙腈-10 mmol·L -1 NH4HCO3(浓氨水调至pH 10.10)=A∶ B系统,梯度洗脱,以ELSD检测.结果贝母素甲在1.09-4.36 μg,贝母素乙在1.04-4.16 μg与峰面积的对数值呈线性关系,回收率分别为98.96%(n=4),RSD 1.01%;98.40%(n=4),RSD 2.63%.结论本方法能够很好地测定浙贝母药材中的主要生物碱贝母素甲、贝母素乙,可用于浙贝母药材的质量控制.

染料木黄酮在Beagle犬体内代谢动力学的剂量依赖性研究

目的研究不同剂量染料木黄酮(genistein)在Beagle犬体内的药代动力学特征.方法将染料木黄酮制成混悬液,按2.67,5.34及10.68 mg·kg -1给Beagle犬灌胃,于灌胃后不同时间在犬前腿部静脉采抗凝血标本,用葡糖醛酸酶溶液处理血浆.采用反相高效液相色谱法测定血浆中母体药物及葡糖醛酸结合型药物浓度,血浆药物浓度-时间数据用3P97药代动力学软件分析.结果染料木黄酮在Beagle犬体内过程符合二室开放模型,当剂量为2.67 mg·kg -1时,母体药物MRT为52.9 min,AUC为6.7 mg·min·L -1,葡糖醛酸结合型药物AUC为33.9 mg·min·L -1;当剂量为5.34 mg·kg -1时,母体药物MRT为224.8 min,AUC为26.1 mg·min·L -1,葡糖醛酸结合型药物AUC为70.1 mg·min·L -1;当剂量为10.68 mg·kg -1时,母体药物MRT为267.7 min,AUC为33.2 mg·min·L -1,葡糖醛酸结合型药物AUC为140.5 mg·min·L -1.结论染料木黄酮首过代谢突出,血浆中药物主要以葡糖醛酸结合形式存在.在一定范围内随给药剂量增加,母体药物的吸收量趋于饱和,药物的血浆消除半衰期延长.