合成生物学在中药资源可持续利用研究中的应用

中药药用活性成分是中药的物质基础.随着合成生物学技术在紫杉醇、青蒿素和丹参酮等研究及生产中的成功应用,合成生物学用于中药资源可持续利用研究逐渐受到广泛关注.本文综述了合成生物学的发展及中药资源可持续利用面临的机遇,国内外药用活性成分合成生物学研究现状及进展;探讨了合成生物学在中药资源可持续利用中的应用;并分析了发展中药合成生物学研究的关键技术方法;预测合成生物学生产将成为中药资源可持续利用的重要途径之一.

先导化合物结构优化策略(二)——结构修饰降低潜在毒性

药物特质性毒性反应能够引发严重的药物毒副作用甚至危及患者生命.含有警惕结构的药物在体内能够产生活性代谢物,这是药物发生特质性毒性反应的一个重要原因.优化药物分子中的警惕结构以及通过结构改造避免警惕结构产生活性代谢物,是药物早期研发中降低药物毒性风险的重要手段.本文通过比对上市与撤市药物,运用实例阐述降低药物毒性风险的结构改造策略,包括封闭代谢位点、改变代谢途径、降低警惕结构反应性、生物电子等排以及前药等.

APOBEC3G抑制病毒复制作用机制研究进展

APOBEC3家族是近年发现的具有脱氨基作用的一类胞苷脱氨酶,APOBEC3G是其家族成员之一,被认为是机体固有免疫家族的新成员,其发现开拓了病毒学领域固有免疫防御机制研究的新方向.APOBEC3G具有抑制多种病毒复制的活性,其机制或通过脱氨基作用引起病毒基因组超突变,或通过非脱氨基依赖的其他复杂机制,作用于病毒的逆转录、复制以及核壳化等生命周期的多个阶段.但病毒会编码病毒蛋白,导致APOBEC3G的抑制病毒复制作用减弱.深入研究APOBEC3G与病毒的相互作用有利于新型抗病毒药物的研发.

以脂蛋白和重组脂蛋白为基础的纳米给药系统研究进展

脂蛋白是人体内天然的脂质运送载体,近年来以脂蛋白及重组脂蛋白为基础的载体的研究得到了广泛发展.本文综述了近年来以天然或重组的低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等为基础设计的载体系统在抗肿瘤领域的研究进展.

生理药动学模型构建方法研究进展

生理药动学模型,作为一种数学机制模型能够模拟药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程,近年来在药物研发领域得到了越来越广泛的应用.本文主要综述了生理药动学模型的构建方法研究进展,包括搭建模型框架、设定组织模型、建立模型方程组、设定模型参数、模拟和评估;并分析了它在药物领域中应用的意义和面临的挑战及前景.

芍药苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑血流量及PGI2/TXA2平衡的影响

探讨芍药苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑血流量变化及PGIJTXA2平衡的影响.取72只雄性SD大鼠,随机分为假手术组、I/R模型组、芍药苷(10、20及40 mg·kg-1)处理组以及尼莫地平组.线栓法制作大鼠局灶性脑缺血(90 min)/再灌注(24 h)模型.观察芍药苷对神经功能缺损评分及梗死体积的影响,采用激光多普勒血流仪监测给药前后大鼠缺血侧局部脑血流量的动态变化,免疫组化法检测缺血侧海马CA1区COX-2的表达;ELISA法测血清中血栓素A2 (TXA2)和前列腺素I2(PGI2)含量并计算PGI2/TXA2比值.结果表明,芍药苷处理组较I/R模型组能显著改善神经功能缺损症状,缩小梗死体积,增加缺血侧大脑局部血流量,抑制COX-2阳性表达,降低TXA2含量,提高PGI2含量及PGI2/TXA2比值.结果提示,芍药苷对局灶性缺血大脑产生神经保护作用的机制可能与其改善缺血侧大脑血流供应,调节PGI2/TXA2平衡有关.

重组人乙酰胆碱酯酶的表达及其抑制剂的筛选

本研究旨在表达重组人乙酰胆碱酯酶(recombinant human acetylcholinesterase,rhAChE)并应用于乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选研究.利用质粒pCMV-AChE瞬时转染HEK293细胞,分泌表达rhAChE.考察rhAChE的酶活性:以碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)为底物进行酶底物动力学研究获得rhAChE的米氏常数Km,以多奈哌齐(donepezil)为抑制剂进行酶抑制作用动力学研究获得Ki、Ki’等参数.利用rhAChE测定新化合物的IC50值,评价新化合物的抑制活性,同时将研究结果与文献报道的提取大鼠AChE的抑制活性进行比较.结果测得rhAChE的Km为151.9 μtmol·L-1,多奈哌齐对rhAChE的抑制作用为竞争性和非竞争性结合的混合类型(Ki=16.03 nmol·L-1,Ki'=18.36 nmol·L-1),rhAChE可应用于抑制剂筛选研究.

新型环磷酰胺类衍生物9b体内外抗肿瘤作用

探讨新型环磷酰胺类衍生物4,6-二苯基环磷酰胺(9b)的体内外抗肿瘤活性及其作用机制.体外采用MTT法观察9b对人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株MCF-7、人白血病细胞株K562的增殖抑制作用;流式细胞仪观察细胞的凋亡率和细胞周期的变化;体内建立肝癌H22荷瘤小鼠模型,观察9b的抑瘤效果.结果表明,9b对体外培养的HepG2、MCF-7、K562细胞有抑制增殖作用,且具有剂量和时间依赖性,9b处理HepG2、MCF-7、K562细胞48 h的IC50分别为32.34、87.07、149.10 μmol·L-1; 9b使HepG2、MCF-7细胞的G0/G1期细胞和K562细胞的G0/G1和G2/M期细胞明显增加,细胞凋亡率随药物浓度增加亦呈增长趋势;9b对H22实体瘤具有明显的抑制作用.结果提示,9b具有明显的体内外抗肿瘤活性,其抑瘤机制可能与细胞周期改变和诱导肿瘤细胞凋亡相关.

基于骨架跃迁和药物拼接所确立的新型二肽基肽酶Ⅳ抑制剂

截至目前,已有7个二肽基肽酶Ⅳ (DPP-Ⅳ)抑制剂成为抗糖尿病新药,它们的结构差异和内在关联性为进一步的结构修饰提供了新的思路.本研究针对阿格列汀和利那列汀的结构特征,采用骨架跃迁及药物拼接的原理,快速得到了新型的DPP-Ⅳ抑制剂8g (IC50=4.9 nmol·L-1),其活性和选择性均接近于上市新药.因此,运用经典的药物化学策略,对基于同一靶标的上市药物实施分子操作,可以有效地产生新型的活性分子.

海洋来源真菌Aspergillus aculeatus中一个新的具有长交叉共轭系统的甾体

本文对海洋来源的内生真菌棘孢曲霉Aspergillus aculeatus)的次级代谢产物进行了研究,从其提取物中分离得到一个新的具有较长交叉共轭系统的甾体类化合物,通过各种波谱分析方法确定其结构为15α-羟基-(22E,24R)-麦角甾-3,5,8(14),22-四烯-7-酮(15 α-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-3,5,8(14),22-tetraen-7-one).测试了该化合物在体外对小鼠白血病细胞株P388、人早幼粒白血病细胞株HL-60、人前列腺癌细胞株PC-3的细胞毒作用.

空气湿度渗透压测定法与Pitzer模型进行交叉验证——以硫酸铵溶液为例

作者提出一种空气湿度渗透压测定法,适用的浓度范围很宽,但在高浓度范围内目前尚无其他测定方法与之对照.为此,采用Pitzer理论模型计算硫酸铵溶液的渗透压,用双T等效性检验及多重检验校正对理论计算值与本空气湿度法及目前常用的冰点渗透压法测定值进行交叉验证.结果表明:采用Pitzer模型的理论计算值与两种方法的测定值一致.虽然冰点法测定值能以更苛严的标准通过此检验,但空气湿度法是目前唯一适用于高浓度溶液的渗透压测量方法.

共载紫杉醇与环孢素的脂质-二氧化硅型复合给药系统制备和表征及其经口服抗肿瘤研究

本文探索构建一种具有脂质-二氧化硅-脂质复合结构的纳米载体,作为可共载多种药物用于抗肿瘤联合治疗的口服递药系统.以具有广谱抗肿瘤活性并为P糖蛋白(P-gp)底物的紫杉醇和P-gp抑制剂环孢素作为模型药物对,并对该给药系统进行制备工艺优化、理化性质与体外释放特性考察、药动学、药效学以及载体安全性系统评价.结果表明,所得共载紫杉醇与环孢素的给药系统制备方法条件温和,操作简易、可控,所得制剂平均粒径为(100.2±15.2)nm,多分散系数(PDI)为0.251±0.018,其对紫杉醇和环孢素的平均包封率分别为(90.15±2.47)％和(80.64±3.52)％.体外释药初步显示环孢素先于紫杉醇释放的序贯释放趋势.体内药动学结果表明,此共载制剂显著提高紫杉醇经口服吸收(相对单一紫杉醇脂质体的相对生物利用度为405.27％).在体内药效学中表现为显著抑制荷瘤小鼠皮下瘤生长,其纳米载体显示出良好的生物相容性.上述给药系统有望为肿瘤及其他重大疾病联合治疗的药物递送研究提供有益思路.

广枣总黄酮对体外培养大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ,Ⅲ型胶原mRNA及蛋白表达的影响

青蒿琥酯干预TGF-β1诱导的肺泡上皮-间质细胞转分化与肺纤维化的关系

黄癸素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的研究

LC-HESI/MS/MS法同时测定人血浆中氨氯地平、贝那普利和贝那普利拉

建立液相色谱-加热电喷雾电离串联质谱(LC-HESI/MS/MS)法同时测定人血浆中氨氯地平、贝那普利和贝那普利拉,并研究复方苯磺酸氨氯地平盐酸贝那普利胶囊在中国健康志愿者体内的药物动力学特性.本法采用ad4-氨氯地平作为氨氯地平的内标、乌苯美司作为贝那普利和贝那普利拉的内标.血浆样品以沉淀蛋白法进行处理,Capcell MG C18柱(100 mm×4.6 mm,5μm)为分析柱,甲醇-乙腈-5 mmol·L-1醋酸铵水溶液-甲酸(30∶30∶40∶0.1)为流动相进行色谱分离;采用加热电喷雾电离源(HESI),SRM扫描方式.氨氯地平在0.02～6.00 ng·mL-1、贝那普利和贝那普利拉在0.2～1 500 ng·mL-1内线性良好(r2＞0.99).氨氯地平、贝那普利和贝那普利拉定量下限分别可达0.02、0.2和0.2 ng·mL-1,各待测物的日内、日间精密度以及准确度均符合生物样品分析相关要求.血浆样品经历4次冷冻-解冻循环和-20℃放置93天条件下均稳定.本方法适合用于复方苯磺酸氨氯地平盐酸贝那普利胶囊的人体药物动力学研究.

盐酸哌甲酯在血浆中的稳定性及其药动学研究

研究哌甲酯(MPH)在人血浆中不稳定性,建立HPLC-MS/MS测定方法并运用于人体药代动力学研究.采用HPLC及LC-MS/MS法考察哌甲酯在醇、水、血浆中的稳定性及甲酸水溶液处理对哌甲酯降解的抑制作用.结果表明,于新鲜制备的人血浆样品(200 μL)中立即加入2％甲酸水溶液10 μL,能够抑制血浆中血浆酯酶的活性.以5 mmol·L-1醋酸铵水溶液(含0.1％甲酸)-甲醇(54∶46)为流动相;使用Sapphire C18柱进行分离.采用电喷雾离子源(ESI+)及多反应监测模式(MRM)进行检测,检测离子为m/z 234.2 →84.1 (MPH),m/z 260.3→ 183.1(普萘洛尔,内标).哌甲酯血浆浓度测定线性范围为0.035～40 ng·mL-1;日内、日间精密度(RSD)均小于5％,准确度为± 2％之内.应用此法研究了6名健康志愿者单剂量口服哌甲酯36 mg后药动学特点.所建方法能准确测定人血浆中哌甲酯的血药浓度,可用于哌甲酯的人体药动学研究.

基于NMR代谢组学技术的不同产地黄芪水溶性浸出物化学组成分析

水溶性浸出物是黄芪质量评价的重要指标.本研究对山西野生黄芪和甘肃栽培黄芪的浸出物含量和化学组成进行了比较.首先参照《中国药典》附录测定两种黄芪的浸出物含量,然后对浸出物进行核磁共振分析,采用聚类分析、主成分分析、正交偏小二乘法分析、微阵列分析以及Spearman rank相关分析等多种统计分析方法找出两种黄芪浸出物的差异成分,并对差异成分之间的相关系数进行分析.结果显示,栽培黄芪的浸出物含量(37.80％)明显高于野生黄芪(32.13％).核磁图谱显示黄芪浸出物中含有的主要成分为蔗糖,此外还含有氨基酸、有机酸等其他18种物质.多种统计分析结果显示,山西野生黄芪浸出物中含有较多的胆碱、琥珀酸、柠檬酸、谷氨酸、牛磺酸和天冬氨酸,甘肃栽培黄芪浸出物中含有较多的蔗糖、精氨酸和富马酸.此外,两种黄芪差异成分之间的相关系数也存在较大差异.本研究结果表明,山西野生和甘肃栽培黄芪的浸出物不仅在含量上有差别,而且在化学组成上也有显著差异,说明生长方式对药材的质量会产生较大影响.本研究为中药材浸出物的比较提供了一种新的思路.

高速逆流色谱结合电喷雾多级串联质谱方法高效分离制备、鉴定五味子木脂素类成分

应用高速逆流色谱技术(HSCCC)从北五味子粗提物中快速分离制备木脂素类成分.采用两种溶剂系统进行洗脱,溶剂系统分别为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1∶5∶5)及正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(9∶1∶9∶5),转速900 r·min-1,流速为2.0 mL·min-1,从五味子粗提物一次分离制备出5种单体成分.利用电喷雾多级串联质谱技术(ESI-MSn)及超高效液相色谱技术(UPLC)对高速逆流色谱分离产物进行结构鉴定及纯度分析.5种单体成分分别为五味子醇甲、戈米辛J、五味子醇乙、五味子酯甲和五味子甲素,纯度分别为98.74％、94.32％、99.53％、94.23％和98.68％.该方法快速、简便,分离效率高,适用于五味子木脂素类成分的制备.

LC-MS/MS法同时测定大鼠血浆中瑞格列奈和普伐他汀钠的浓度及其在药动学相互作用研究中的应用

建立同时测定大鼠血浆中瑞格列奈和普伐他汀钠浓度的LC-MS/MS方法,并初步考察两药的药动学相互作用.将18只雄性SD大鼠随机分成单用瑞格列奈组、单用普伐他汀钠组和联合用药组(n=6),于给药前后不同时间点股动脉采集血样,采用LC-MS/MS同时测定两药的血药浓度.色谱柱为Agilent HC-C18,流动相为甲醇-0.1％甲酸水溶液(80∶20),等度洗脱,柱温为30℃.质谱条件为电喷雾离子源(ESI源),正离子模式检测,扫描方式为多反应监测(MRM),定量离子对为m/z 453.3→230.1(瑞格列奈),m/z 447.2 →327.4(普伐他汀钠),m/z285.1→192.9(地西泮,内标).瑞格列奈、普伐他汀钠检测质量浓度线性范围分别为9.77～10 000 ng·mL-1 (R2=0.999 9)和4.88～625 ng·mL-1(R2=0.999 6).与单用瑞格列奈组相比,联合用药组瑞格列奈Cmax增加1.5倍(P＜0.01),AUC0-6 h明显增加(P＜0.05),V1/F显著减小(P＜0.01).与单用普伐他汀钠组相比,联合用药组普伐他汀钠tmax显著延长(P＜0.01).该方法专属性强、灵敏度高、准确性好,可用于瑞格列奈和普伐他汀钠血药浓度的同时测定,且大鼠单次同时服用两药时存在一定的药动学相互作用.

罗汉果果实RNA的提取及SgDHAR基因的克隆与表达

针对罗汉果果实富含酚类、多糖、油脂和蛋白质等特点,从3种常用的RNA提取方法中优选出改良Trizol法,应用该法得到的RNA纯度高(OD260/280=2.01;OD260/230=2.02)、完整性好(RIN=9.50)、得率高(260μg·g-1).以该法提取的RNA为模板,通过RACE和RT-PCR技术克隆罗汉果脱氢抗坏血酸还原酶基因全长,其长度为1 252 bp,开放阅读框(ORF)为819 bp,命名为SgDHAR,GenBank登录号为KC907731,编码一条272个氨基酸的肽链,理论分子量为30.217 7kD,等电点为8.76.该蛋白与GenBank中已登录的DHAR序列比对显示与黄瓜同源性高(87％).应用实时荧光定量PCR对SgDHAR在罗汉果不同组织及不同倍性中的表达模式分析发现,该基因主要在果实和茎中表达,其次是花,根中的表达量低;在三倍体中的表达量为二倍体的6.83倍,推测该基因可能参与了三倍体无籽罗汉果的败育过程.

三七病程相关蛋白1基因的克隆与表达分析

在生物信息学分析基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从三七中获得病程相关蛋白1(pathogensis-related protein 1,PRI)基因的开放阅读框,命名为PnPR1,测序结果显示该序列长501 bp,编码166个氨基酸,其蛋白质分子质量为18.1 kD.利用NCBI/Blastp和BioEdit软件进行同源性比对显示,PnPR1基因编码蛋白与葡萄、烟草、番茄等高等植物中的PR1蛋白同源性较高,且具有相同的富含半胱氨酸蛋白的保守结构域.将构建的重组载体pET28a(+)-PnPR1在宿主菌Escherichia coli BL21中经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白,在不同诱导时间、诱导温度、IPTG诱导浓度和IPTG添加时间下对诱导条件进行优化.十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,PnPR1基因编码蛋白的佳诱导条件为:IPTG终浓度0.4 mmol·L-1、IPTG添加时间为转接后4h、诱导温度28℃、诱导时间20 h.这为蛋白纯化及单克隆抗体的制备奠定了一定的基础.

从天然产物到免疫调节药物芬戈莫德

1 天然活性物质多球壳菌素的发现免疫抑制剂环孢素A和FK506分别是真菌Tolypocladium inflatum和细菌Streptomyces tsukubaensis的代谢产物,初作为抗真菌药,后来证明具有免疫抑制作用,广泛用于临床.20世纪90年代初,藤田等研究真菌代谢产物时,发现环状肽(cyclic depsipeptide)是有活性的抗生素,由于该环肽以前从Isaria sinclairii(辛克莱棒束孢)得到,故转向研究Isaria sinclairii,它是原产中国和东亚的辛克莱虫草(Cordyceps sinclairii)的真菌,而辛克莱虫草与冬虫夏草(Cordyceps sinensis Sacc)很相近,因而从冬虫夏草中研究新的活性成分.