缺氧诱导因子-1α和血管内皮细胞生长因子在胶原性关节炎动物模型中的表达与意义

建立Wistar大鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)模型.探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)在CIA中的表达,为类风湿关节炎的发病机制及治疗前景提供线索.采用50只Wistar大鼠,随机分为对照组与模型组,将牛Ⅱ型胶原与福氏不完全佐剂乳化混匀作为免疫混合物,尾根部皮内注射,建立CIA模型.于造模第21、28、35、42天取踝关节和滑膜组织行HE染色及免疫组化染色,动态观察各项关节炎活动指标和检测HIF-1α和VEGF在CIA关节炎中的表达,并分析两者在CIA中的相关性及HIF-1α与滑膜病理学评分之间的关系.组织形态学和影像学结果显示,CIA大鼠的滑膜组织、关节软骨及骨组织均呈典型的关节炎病变,免疫组化结果显示CIA大鼠关节滑膜层和滑膜下层均表达HlF-1α和VEGF,第21天阳性表达量高,随病程进展.表达逐渐下降;统计学分析表明HIF-1α和VEGF的表达水平呈正相关(r=0.75,P<0.01),HIF-1α的表达水平与滑膜病理学评分和血管生成评分呈正相关(r1=0.48,r2=0.5,P<0.05).以上结果提示HIF-1α可能通过调控一系列下游靶基因,如VEGF等,促进滑膜增生及血管生成,影响RA的发生与发展.

一株抗人OX40激发型单克隆抗体的研制及其生物学功能的初步研究

鼠抗人OX40分子激发型单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.以高表达人OX40分子的基因转染细胞L929-OX40为免疫原,常规免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠;采用B淋巴细胞融合技术,将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,并以L929-OX40细胞为阳性筛选细胞,L929-Moek细胞为阴性筛选细胞,采用免疫荧光技术对杂交瘤进行反复筛选及多次克隆化培养;采用快速定性试纸法检测抗体亚型;竞争抑制实验分析抗原结合表位;Western blot检测抗体特异性;采用MTT法分析单抗在体外对T细胞增殖的促进作用,并采用ELISA检测培养上清中的细胞因子.结果:获得一株稳定、高效分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:9H8),该株mAb能够特异性识别U937、Jurkat、Thp-1等血液来源肿瘤细胞株表面OX40分子,并且能够有效促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌.成功研制了一株分泌鼠抗人OX40分子激发型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该抗体能够特异性识别人OX40分子并能够介导OX40正性协同刺激效应.

抗苏丹红I号单抗的制备及用于检测食品中苏丹红含量的酶联免疫方法建立

将羧基苏丹红I号分别与BSA和OVA偶联,制得免疫抗原和包被抗原.免疫BALB/c小鼠,取脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/O融合,筛选获得能分泌抗羧基苏丹红抗体的杂交瘤细胞株.将该细胞株接种BALB/c小鼠腹腔,产生的腹水经辛酸-饱和硫酸铵法纯化获得腹水型苏丹红单克隆抗体,效价为1:128 000.以该腹水型单抗建立的对苏丹红I号和对位红的竞争ELISA检测法,IC50.值分别为0.8 μg/L和4 μg/L,与苏丹红Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ号和其他染料的交叉反应率均小于2.2%.用乙腈法提取番茄酱中的苏丹红I号或者对位红,回收率为69.8%～118%.该方法灵敏特异,可作为快速检测食品中添加苏丹红I号和对位红的初筛方法.

非肥胖型糖尿病小鼠模型子宫NK细胞CD 122表达特征

探讨CD122分子表达水平与非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠生育力低下的关系.采用磁珠亲和细胞分选术分离小鼠子宫NK细胞,采用流式细胞术检测NK细胞表达CD122分子的情况,比较与C57BL/6雄鼠同笼而受孕的NOD小鼠(NOD×C57BL/6)与对照组BALB/cXC57BL/6小鼠流产率的差异以及CD122表达水平的差异.结果显示,NODXC57BL/6小鼠孕12.5 d胚胎吸收率显著高于BALB/c×C57BL/6对照组(分别为25.7%和2.4%,P<0.01),而其子宫NK细胞CD122阳性率显著低于对照组(分别为28.1%和51.4%,P<0.01).进一步检测发现,这些细胞不表达CD3和CD4分子.过继输注BALB/c×C57BL/6孕鼠子宫NK细胞可降低NOD×C57BL/6小鼠胚胎丢失率,而注射中和抗体阻断CD122可升高NODXC57BL/6小鼠和BALB/c×C57BL/6小鼠胚胎丢失率.这些结果提示,NOD×C57BL/6小鼠自发性胚胎丢失率增高可能与缺乏足够的CD122阳性子宫NK细胞有关.

miR-125a调节系统性红斑狼疮患者T细胞炎症性趋化因子RANTES的表达

微小RNA(microRNA,miRNA)作为一种基因表达调控因子,在自身免疫性疾病中起重要作用.本研究旨在研究系统性红斑狼疮(SLE)患者中低表达的miR-125a基因在SLE炎症反应中的作用及其可能的作用机制.通过miRNA Taqman荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR),发现同正常对照组相比,miR-125a表达水平在SLE患者中明显降低.生物信息学分析发现T淋巴细胞激活晚期促进RANTES分泌的主要转录因子KLF13是miR-125a的潜在靶基因.定量结果也表明,SLE患者中KLF13和RANTES水平正相关.从基因组DNA中克隆pri-miR-125a基因,构建miR-125a的表达载体.在HeLa细胞中过表达miR-125a能抑制内源性KLF13 mRNA的表达,反之亦然.报告基因系统实验证实,miR-125a能直接作用于KLF13的3'UTR区,从而调节KLF13的表达.进一步发现过表达miR-125a可以降低狼疮T细胞分泌RANTES的水平.我们的研究表明,miR-125a通过调节转录因子KLF13的表达而调节参与狼疮发病的炎性趋化因子RANTES的分泌.这提示定向干预miR-125a的表达水平可调节炎症性趋化因子RANTES的表达,从而发展为SLE新的治疗手段.

药物包被的红细胞检测血液中抗抗生素抗体

检测上海地区就医人群血液中针对抗生素类药物抗药物抗体的产生情况.选取在上海市血液中心进行交叉配血与Coombs'试验及进行骨髓移植的患者血浆,选取上海地区使用率靠前的9种抗生素类药物包被的RBC,采用试管法与凝胶法进行间接抗球蛋白实验,检测血浆中是否有抗药物抗体的存在.结果成功制备了青霉素包被的RBC并得到证实;所有被检测的181个样本中.有8例样本(4.42%)发现有抗青霉素特异性抗体的存在;1例样本(0.55%)存在抗头孢菌素类药物的抗体;还有2例样本(1.1%)含有非特异性抗药物抗体.在适当的缓冲体系中及一定浓度的药物溶液中可以成功制备药物包被的RBC并用于血浆中抗药物抗体的检测.有一定比例的就医人群在使用某些抗生素后会产生抗药物抗体,可以通过使用药物包被的RBC得到检测.

子痫前期患者外周血HLA-G水平及CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T细胞亚群比例与眼底病变的关系研究

探讨子痫前期患者外周血HLA-G水平及调节性T细胞亚群的变化与眼底病变的关系.分别采用ELISA法和流式细胞技术检测28例住院子痫前期患者(轻、重组)产前和产后血清HLA-G水平和外周血T细胞CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值,并引入14例正常妊娠待产产妇作对照组,对比分析各组HLA-G水平及CD4+CD25+Foxp3+/CD4+与眼底病变的关系.结果不同病情子痫前期患者之间产前HLA-G水平具有统计学意义(P<0.01),产前、产后不同病情子痫前期患者CD4+CD25+Foxp3+/CD4+具有统计学意义(P<0.01),并且随着病情加重而降低;不同程度眼底病变之间产前HLA-G水平具有统计学意义(P<0.01)产前、产后不同程度眼底病变之间CD4+CD25+Foxp3+/CD4+具有统计学意义(P<0.01),并且随眼底病变加重呈下降趋势.产前、产后眼底病变与病情程度之间有显著相关性(P<0.01).子痫前期患者外周血HLA-G水平及CD4+CD25+Foxp3+/CD4+是反映子痫前期病情和眼底视网膜病变程度的指标之一.

AT1受体抗体对大鼠心肌结构和功能的影响

实验观察血管紧张素Ⅱ-1型受体自身抗体(angiotensintype-1 receptor autoantibody,AT1R-AA)对大鼠心肌结构和功能的影响.选用2月龄健康SD大鼠,用合成的AT1受体细胞外第二环肽段(165-191)对其进行主动免疫,对照组只用免疫佐剂.ELISA法检测AT1R-AA滴度,大鼠尾动脉血压计测量血压和心率;实验结束时进行在体心功能和心脏形态学检测;应用Protein A亲和层析法,从大鼠血清中提取AT1R-AA,作用于培养的心肌细胞,用BCA法测定心肌细胞蛋白含量、显微测微器测定心肌细胞直径.结果显示,6周时大鼠免疫组血清中可检测到高滴度的AT1R-AA,与对照组相比血压升高,心功能指标中LVSP,+dp/dt max,-dp/dt max均明显增强,左心室与体重比值增加;AT1R-AA可使培养的细胞蛋白合成增加、体积增大.提示AT1R-AA在体内外均可引起心肌肥大.

EGCG治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎免疫学作用机制研究

为了探讨表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的免疫学作用机制.通过用MOG35-55肽段免疫小鼠建立EAE疾病模型,分别获取EGCG治疗组及对照组小鼠体内MOG35-55特异性T细胞,3H掺入法检测EGCG对其增殖的影响;ELISA方法检测培养上清中IFN-γ、IL-4及TNF-α的含量;Western blot方法检测NF-κB信号通路中IKK和IκB蛋白表达水平;定量PCR技术检测Th1和Th2细胞转录因子T-bet及GATA-3基因表达水平.结果显示:EGCG治疗明显抑制MOG特异性T细胞的增殖;抑制炎性细胞因子IFN-γ及TNF-α的表达,并增加IL-4的表达水平;抑制NF-κB信号通路中IKK蛋白的表达;调节Th1/Th2细胞分化过程中特异性转录因子T-bet及GATA-3基因表达水平.研究结果表明,EGCG通过抑制MOG特异性T细胞增殖,抑制IKK蛋白表达,促使Th1型细胞向Th2型细胞转化等途径治疗EAE,为今后临床研究治疗多发性硬化症药物提供实验基础.

野生型和突变型人白介素13的大肠杆菌表达及活性分析

利用大肠杆菌表达野生型和突变型重组人白介素13(IL-13),以获得具有生物学活性的重组蛋白.采用PCR方法从质粒pET22b-hIL-13上扩增人成熟IL-13的编码序列.用定点突变引物扩增IL-13突变体(IL-13m)编码基因.将IL-13和IL-13m编码基因分别克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建质粒pET28a(+)-IL-13和pET28a(+)-IL-13m,然后将质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,构建重组体,IPTG诱导重组蛋白表达.重组蛋白采用镍柱(Ni-NTA)纯化,纯化后复性,并分析其生物学活性.结果成功得到IL-13和IL-13m重组蛋白,经SDS-PAGE分析.在相对分子质量约14.6 kD的位置出现明显蛋白条带,经Western blot证实为重组hIL-13蛋白;重组蛋白主要以包涵体形式存在.纯化复性后,重组蛋白具有生物学活性.后成功获得了具有生物学活性的野生型和突变型重组人IL-13,为后续研究奠定了基础.

IL-21修饰的脐血间充质干细胞对卵巢癌裸鼠治疗作用

探讨IL-21修饰的脐血间充质干细胞(UMSC)对荷卵巢癌裸鼠的治疗作用.从脐血单个核细胞中培养UMSC,经流式细胞术(FCM)鉴定后用于重组体pIRES2-IL-21-EGFP转染.RT-PCR检测LJMSC中IL-21的表达.荷瘤裸鼠治疗实验分为PBS、IJMSC、15MSC空质粒和UMSC-IL-21四组.以肿瘤大小、荷瘤鼠生存期判断IL-21修饰的UMSC对荷瘤鼠的治疗效应.以ELISpot法检测脾细胞IFN-γ分泌、免疫荧光法检测肿瘤组织中IL-21、NKG2D的表达,并同时检测了NK细胞活性.结果显示,脐血分离的单个核细胞经三代培养后已初步符合UMSC表型,pIRES2-IL-21-EGFP转染的IJMSC能表达IL-21和EGFP.UMSC-IL-21治疗组,能抑制肿瘤生长,延长荷瘤裸鼠生存期,与其他组相比,差异有明显统计学意义(P<0.01).UMSC-IL-21组肿瘤局部能表达IL-21与NKG2D、脾细胞分泌IFN-γ能力升高,NK细胞杀伤活性增强,表明IJMSC-IL-21有良好地抗裸鼠卵巢癌作用,其机制可能与表达IL-21诱导IFN-γ分泌增加,激活NK细胞活性有关.

肝癌特异性黏附肽A54体外靶向治疗研究

对药物偶联后的肝癌特异性黏附肽进行体外靶向效果评价,并开展初步的药效学研究.将与阿霉素偶联的肝癌特异性黏附肽A54和突变对照肽A54M分别作用于肝癌细胞株BEL-7402,通过细胞活性检测、荧光观察、流式细胞仪分析以及细胞存活实验,对阿霉素偶联药物的靶向杀伤效果及作用机制进行研究.结果:与对照组相比,DOX-A54(doxorubicinconjugated peptide A54)处理后肿瘤细胞的活性明显降低.荧光显微镜观察发现,相同处理时间后,DOX-A54组的细胞核内阿霉素富集程度与对照组相比明显提高.此外,细胞凋亡和细胞存活实验表明新型免疫毒素对肝癌细胞的毒性作用主要是通过导致细胞坏死而非促进细胞凋亡产生的.研究提示,这种偶联阿霉素的肝癌特异性黏附肽在体外对肝癌细胞有一定的靶向杀伤作用.具有潜在的应用前景.

let-7/miR-98家族对Fas基因的调节作用

Fas在自身免疫病及肿瘤中发挥重要的作用.微小RNA是一种起负调控作用的分子.本研究旨在探索微小RNA对Fas基因的调节作用.生物信息学分析可能调节Fas基因表达的微小RNA,并通过聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测其对Fas基因表达的影响.利用定点突变和双荧光报告基因系统来验证微小RNA对Fas基因的直接调节作用.后通过流式细胞术检测微小RNA对Fas介导的细胞凋亡的影响.结果.生物信息学分析发现let-7/miR-98家族可以调节Fas基因的表达.过表达miR-98可以降低Fas基因蛋白和mRNA水平的表达,反之,抑制miR-98可以增加Fas基因的表达.双荧光报告基因系统及定点突变实验显示:let-7/miR-98家族可直接调节Fas基因3'UTR.细胞凋亡检测显示:过表达miR-98可抑制Fas介导的细胞凋亡,抑制miR-98可以增加Fas介导的细胞凋亡.这说明let-7/miR-98家族可以直接调节Fas基因的表达并影响Fas介导的细胞凋亡,并可能成为干预Fas参与的相关疾病的一种新药物.

TRAF6在机体炎症和免疫应答中作用的研究进展

RA治疗新靶点——信号转导通路的调节

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性多系统性炎症性的自身免疫性疾病,多引起受累关节的破坏.在RA发病过程中,多种RA相关炎性细胞参与其中,如T淋巴细胞、成纤维样滑膜细胞(FLS)和巨噬细胞.目前用抗炎症因子生物制剂抑制RA相关炎性细胞间信号转导,来改善RA的炎性破坏已得到广泛的证实.信号转导通路具有重要的细胞周期调节功能.同时对细胞的发生、发展和凋亡也发挥着重要的作用.大量的实验已证实ERK、p38/MAPK等信号通路的抑制剂能够改善RA病情.通过对RA相关炎性细胞间信号转导通路研究的不断深入,将可能为我们在RA的治疗中开辟一条崭新道路.

Th17与Treg在系统性红斑狼疮发病机制中的作用

抗原特异性调节性T细胞的扩增方法及应用前景

调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是一种新型的免疫抑制性调节细胞,在维持正常机体免疫耐受和免疫稳态中发挥重要作用,与自身免疫性疾病、变态反应性疾病、器官移植耐受、母胎免疫耐受及肿瘤免疫等密切相关.抗原特异性Treg可针对特异性的抗原发挥作用,其作用优于多克隆性Treg,但因体内含量较少,且体外扩增困难,使其应用受到极大限制.因此.如何高效诱导、扩增抗原特异性Treg以用于特异性免疫治疗已成为重要研究课题.本文就近年来抗原特异性Treg的扩增方法及应用进展作一综述.