中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位： 中国科学技术协会
- 主办单位： 中华医学会
- 影响因子： 0.75
- 审稿时间： 1-3个月
- 国际刊号： 1001-9030
- 国内刊号： 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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山羊骨组织内抗生素缓释模型的建立及评估
目的 建立山羊股骨远端骨洞模型,观察万古霉素缓释微球在模型体内释放药物的过程.方法 山羊双侧股骨远端形成两个圆柱形骨洞,PMMA封闭14 d后,再次暴露骨洞,分别在右侧和左侧移植万古霉素微球和无万古霉素的微球.通过高效液相检测各部位的万古霉素浓度,并以葡萄球菌作为检测菌株,评估其抗菌活性.结果 X线见骨洞约为2.5 cm×1.5 cm×1.5 cm,移植微球后右侧骨洞内的万古霉素浓度高,1 d达高值(294.71±20.45)mg/L;左侧和血液中的浓度在2 d达高峰,为(5.54±0.97)mg/L和(29.98±2.61)mg/L;超过对葡萄球菌敏感折点值(5 mg/L)的持续释放天数分别为21、1、6 d.结论 建立的山羊股骨远端骨洞模型适合于观察药物缓释载体在骨组织内释放药物的动态过程,便于检测洗脱出的药物浓度.
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缺血预处理对肝大部切除术中残肝缺血再灌注损伤的保护作用
目的 观察缺血预处理对大鼠肝大部切除术中残肝缺血再灌注损伤的保护作用.方法 健康的雌性SD大鼠随机分为3组:即单纯肝叶切除组(PH组)、缺血再灌注损伤状态下肝叶切除组(IR组)及缺血预处理组(IP组).分别取术前及术后0.5、6、12、24、48 h等时间点,应用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST含量,通过免疫组织化学法检测残肝组织中Ki67和Cyclin D1表达变化,采用放免法检测血清中透明质酸(HA)含量.结果 IP组术后24 h内各检测点的AST和ALT值明显高于PH组和IR组(P＜0.05).术后早期IP组大鼠的血清HA表达量明显高于PH组和IR组(P＜0.05).PH组大鼠肝细胞Ki67和Cyclin D1表达在术后24 h达到峰值,并且明显高于IR组和IP组大鼠(P＜0.05).其中IP组大鼠术后Ki67和Cyclin D1表达量降低地显著.结论 在合并肝组织大部缺失时,缺血预处理对残留肝组织的缺血再灌注损伤的保护效应消失,它损害了大鼠残肝再生功能.
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多器官功能障碍综合征大鼠小肠神经-Cajal间质细胞网络变化及意义
目的 观察多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠小肠胆碱能/氮能神经-Cajal间质细胞(ICC)网络形态学的变化并探讨其意义.方法 Wistar大鼠随机分为对照组(20只)、MODS模型组(20只),行小肠肌层全厚标本c-Kit和乙酰胆碱囊泡状转运体(VAChT)/神经性一氧化氮合酶(nNOS)免疫荧光双重标记,共聚焦显微镜观测小肠神经-ICC网络结构的变化并进行定量分析.结果 对照组单个高倍视野ICC和胆碱能/氮能神经纤维数量分别为:(18.0±2.2)个,(28.0±1.3)个,(16.0±0.3)个;c-Kit和VAChT/nNOS免疫阳性荧光强度分别为:(30.0±3.4)、(208.0±10.4)、(222.0±4.4)U;MODS模型组ICC和胆碱能/氮能神经纤维数量分别为:(6.0±0.5)个,(13.0±1.1)个,(7.0±0.5)个;c-Kit和VAChT/nNOS免疫阳性荧光强度分别为:(8.0±1.2)、(98.0±9.1)、(96.0±7.9)U;对照组各组数据与MODS模型组相应的数据比较有明显的差异(P＜0.01),MODS组小肠神经-ICC网络结构不连续.结论 MODS大鼠小肠胆碱能/氮能神经-ICC网络结构受到明显破坏,MODS大鼠胃肠运动障碍可能与小肠神经-ICC网络损伤有关.
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羟乙基淀粉溶液对猪小肠移植缺血再灌注损伤的保护作用
目的 探讨羟乙基淀粉溶液做为器官灌洗液对猪小肠移植缺血再灌注损伤的保护机制.方法 建立同种异体猪原位节段性小肠移植模型.对照组和实验组分别采用0.9%生理盐水(n=6)和3%羟乙基淀粉氯化钠溶液(n=6)灌洗,移植小肠(截取供体约500 cm小肠)保存于4℃0.9%生理盐水2 h.分别于移植前30 mim和再灌注后30min采取肠液和血清,检测ALT、CK、LDH的变化;测定再灌注后肠液分泌量;检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6的含量.同时取移植小肠行病理学检查.结果 再灌注30 min后,实验组肠液分泌量明显少于对照组(P＜0.05),两组肠液中CK水平较术前明显增加(P＜0.05),实验组肠液中CK水平明显低于对照组(P＜0.01);对照组再灌注30 min后血清TNF-α、IL-6、IL-1的含量较术前明显增加(P＜0.05),实验组与术前无明显变化(P＞0.05);两组再灌注30 min后肠液和血清ALT、LDH的水平与术前无明显变化(P＞0.05);对照组血清中CK明显低于实验组(P＜0.05);实验组肠黏膜的组织损伤程度较对照组减轻.结论 3%羟乙基淀粉氯化钠溶液可能通过抑制TNF-α、IL-6、IL-1水平,阻止毛细血管渗漏,减轻细胞水肿,防止肠缺血再灌注损伤,再灌注后肠液分泌量及肠液CK水平可用来判定肠组织损伤程度.
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次级淋巴趋化因子(SLC/CCL21)基因与肿瘤裂解产物构建树突状前列腺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用研究
目的 探讨转染次级淋巴趋化因子基因的树突细胞(DC)瘤苗在小鼠前列腺癌中的抗肿瘤效应.方法 通过脂质体法将次级淋巴趋化因子基因转染至小鼠骨髓来源的树突状细胞,构建DC瘤苗;逆转录-聚合酶链反应检测SLC;种瘤24 d后SLC组的瘤体平均体积为(1430±86)mm3,45 d后仍有50%的荷瘤小鼠存活,与其他两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);免疫组织化学荧光染色可见SLD组中CD4+、CD8+T细胞和CD11+DC的浸润率分别为(15.24±0.67)%、(¨.02±0.73)%和(14.50±0.51)%,与DC组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 转染SLC的DC瘤苗能有效诱导抗肿瘤的免疫效应,其免疫效应是通过趋化大量CD4+、CD8+T细胞及CD11+DC至肿瘤部位而发挥作用.
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SHH和PTCH蛋白在膀胱移形细胞癌中的表达及其意义
目的 探讨Hedgehog信号通路中SHH和PTCH蛋白在膀胱移行细胞癌中的异常表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学方法检测30例膀胱癌及10例正常膀胱黏膜中SHH和PTCH蛋白的表达情况,并分析其阳性率与肿瘤分级分期的关系.结果 SHH和PTCH蛋白表达于膀胱移行细胞癌细胞的胞质,阳性表达率分别为53.33%和60.00%,正常膀胱黏膜中未见两者的阳性表达;SHH、PTCH蛋白在表浅性膀胱癌的阳性表达率分别为70%和75%,高于浸润性膀胱癌(P＜0.05);SHH、PTCH蛋白在高中分化膀胱癌的阳性表达率分别为68%和79%,高于浸润性膀胱癌(P＜0.05).结论 SHH和PTCH蛋白在膀胱癌中过度表达,两者的阳性率与膀胱癌的分级分期有关,提示Hh通路的激活可能部分参与膀胱癌的发生过程.
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兔颞下颌关节盘前移位后滑膜组织中血管内皮生长因子的表达及意义
目的 观察颞下颌关节盘前移位动物模型的滑膜组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平的变化,探讨其在关节盘前移位致病机制中的作用.方法 10只4～6月龄日本大耳白兔,随机分为正常对照组(2只),手术和手术对照组(8只),手术使颞下颌关节盘前移位;术后1、2、4、8周分别处死2只动物;免疫组织化学方法检测滑膜组织中VEGF的表达.结果 正常对照组以及对照侧滑膜组织VEGF表达呈阴性,实验侧滑膜组织术后VEGF呈阳性,并且VEGF的表达随时间发生改变.结论 颞下颌关节盘前移位滑膜组织中VEGF表达增强,说明其可能参与了这种病症的发病机制.
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60%泛影葡胺皮下注射治疗家兔淋巴漏
目的 观察60%泛影葡胺皮下注射对家兔淋巴瘘的治疗作用.方法 对90例家兔采用腹股沟部手术形成淋巴瘘模型.模型建立后第3天以60%(V/V)泛影葡胺溶液于该侧股血管走行区域分点2～3点皮下浸润注射,必要时重复注射.记录局部引流量及治疗显效率.1周后观察局部大体病理变化情况.结果 术后模型成功78侧(48.1%),实验组40侧,共行60%泛影葡胺注射81次219点,对照组38侧,共行0.9%生理盐水注射107次289点,实验组注射后每日局部引流量与对照组比较明显减少(P＜0.01).注射后每日治疗累计显效率明显提高(P＜0.05).术后1周大体病理见局部血管神经组织周边粘连明显,与周围组织融合呈条索状,部分已成瘢痕样改变,两组间手术感染率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 术后淋巴瘘的发生可能与手术部位广泛分离、假腔形成、淋巴液回流量和感染等有关.泛影葡胺局部皮下注射治疗淋巴瘘疗效显著,应早期应用.重复注射可有效提高治愈率.同时具有防止淋巴管感染作用.皮下注射其优势在于费用低廉,同时局部刺激作用较轻,耐受性良好.
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PD-L1.Ig与1,25(OH)2D3联合应用对异基因大鼠胰腺移植后急性排斥反应的影响
目的 探讨PD-L1.Ig联合1,25(OH)2D3对大鼠胰腺移植急性排斥反应的免疫调控作用以及对大鼠移植胰腺存活时间的影响.方法 以F344大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,建立4组原位胰腺移植模型.每组12例,共48例.A组:对照组、B组:PD-L1.Ig组、C组:1,25(OH)2D3组、D组:PD-L1.Ig+1,25(OH)2D3组;观察术后各组血糖变化,移植物存活以及组织病理学改变;流式细胞检测受体血、脾以及移植胰CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD25+T细胞表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测移植物局部白细胞介素(IL)-2、-4、-10、-12表达水平;于术后第7天分别杀死各组受体和供体鼠各2只,取受体脾细胞与供体作混合淋巴细胞反应(MLR).结果 与A比较,PD-L1.Ig组并未显著延长移植胰腺存活时间(P＞0.05),C、D组对改善血糖水平和延长移植胰腺存活时间作用明显(P＜0.01),其中,D组移植胰腺存活时间长(23.9±0.8)d;与A组比较,B组无明显改善,C组排斥反应较A组明显减弱,而D组几乎未发生排斥反应;CD3+CD8+T细胞计数D、C、B与A组比较均有减少,差异有统计学意义(P＜0.01).CD4+T细胞D、C、B与A组的差异有统计学意义(P＜0.05).CD4+CD25+调节性T细胞A、B、C、D组逐渐升高,差异有统计学意义(P＜0.01),且以D组较为明显(C组比A组P＜0.01);D组明显抑制移植物局部Th1型细胞因子IL-2、IL-12的产生,显著提高Th2型细胞因子IL-4、10的水平;与对照组比较,各治疗组受体T淋巴细胞在MLR中表现对供体淋巴细胞特异性低反应性,能有效抑制T细胞对同种异体抗原的反应.结论 共刺激阻断剂PD-L1.Ig联合1,25(OH)2D3可有效抑制细胞免疫应答,干预急性排斥反应,显著延长大鼠移植胰腺存活时间.
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可溶性转化生长因子βⅡ型受体对大肠癌生物学行为的影响
目的 探讨可溶性转化生长因子βⅡ型受体(sTGF-βRⅡ)对大肠癌LoVo细胞生物学行为的影响.方法 采用DNA重组技术构建sTGF-βRⅡ的表达载体pcDNA3.1(+)/sTGF-βRⅡ,转染人大肠癌LoVo细胞,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot和免疫荧光技术分别检测目的 基因及其蛋白表达.噻唑蓝(MTr)比色法和平板法集落形成实验检测sTGF-βRⅡ对LoVo细胞增殖的影响,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术检测sTGF-βRⅡ对LoVo细胞凋亡的影响,MatrigelTM侵袭试剂盒检测sTGF-βRⅡ对LoVo细胞侵袭能力的影响.结果 sTGF-βRⅡ在LoVo细胞中获得表达.sTGF-βRⅡ可抑制TGF-β1作用下的LoVo细胞增殖、凋亡和体外侵袭能力.结论 sTGF-βRⅡ可拮抗TGF-β1的信号传导,对大肠癌LoVo细胞的侵袭能力具有一定的抑制作用,在大肠癌的治疗中可能有一定的作用.
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输注受者骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠免疫功能的影响
目的 观察肝移植同时输注受者骨髓间充质干细胞(MSCs)对受者肝移植免疫功能的影响.方法 实验分为4组:A组SD大鼠只行剖腹探查;B、C、D组各组行Wistar-SD大鼠肝移植同时,C组提取受者MSCs同期经门静脉输注给受者,D组给予肌注CsA,B组给予门静脉输注生理盐水.观察术后第1、7、14天肝功能的变化、病理改变和细胞因子变化.结果 肝移植同时输注受者MSCs,谷氨酸转移酶、血清总胆红素较对照组显著降低,病理改变仅呈急性轻度排除反应,与肌注CsA组相似,而单纯移植组呈急性重度排除反应.术后第7天,白细胞介素(IL)-2和干扰素(IFN)-γ浓度,C组分别为(443.89±2.39)、(347.55±3.35)ng/L,B组分别为(600.36±2.98)、(373.77±1.81)ng/L,而IL-4和IL-10浓度,C组分别为(126.99±1.18)、(147.40±1.07)ng/L,B组分别为(102.02±0.94)、(111.03±1.15)ng/L,C组和B组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 肝移植同时输注MSCs,可通过抑制Th1细胞因子的表达,减轻受者对移植肝的排斥反应.
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雷帕霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用
目的 探讨雷帕霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及机制.方法 建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型24只,随机分为对照组、RAPA小剂量组(每日1 mg/kg体重)、RAPA大剂量组(每日5 mg/kg体重).用药4周后观察肿瘤体积和重量、肿瘤组织切片行透射电镜检查、荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测肿瘤的血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定裸鼠血VEGF、MMP-2浓度.结果 与对照组比较,雷帕霉素小剂量组和大剂量组均能抑制肿瘤生长[(0.42±0.17)cm3和(0.38±0.21)cm3比(0.78±0.25)cm3,P＜0.05];VEGF mRNA、MMP-2 mRNA的转录和翻译显著减少(P＜0.01).结论 雷帕霉素可以通过抑制肝癌细胞VEGF和MMP-2的mRNA转录和蛋白表达,抑制肿瘤生长,但不呈剂量依赖性.
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雷公藤多甙对白细胞介素-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364基质金属蛋白酶-3、c-Jun基因表达的影响
目的 观察雷公藤多甙对白细胞介素(IL)-1β诱导大鼠滑膜细胞株RSC-364基质金属蛋白酶-3(MMP3)、c-Jun mRNA表达的影响.方法 选择不同浓度的雷公藤多甙作用IL-1β刺激的大鼠滑膜细胞株RSC-364,37℃,5%CO2的环境下培养48 h,运用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清的MMP3和实时聚合酶链反应(real-time PCR)检测分析细胞中的c-Jun mRNA表达.结果 不同浓度的雷公藤多甙(0、5、10、20 mg/L)对IL-1β刺激的大鼠滑膜细胞株RSC-364分泌MMP3的水平依次是198、176、140、115 μg/L,c-Jun mRNA表达分别是1.17×106、3.31×105、9.32 ×104、2.81 ×104copies/ml,即呈现明显地抑制.重要的是:c-Jun mRNA表达抑制呈现明显的剂量依赖性.结论 雷公藤多甙治疗类风湿性关节炎的有效的作用机制,可能与其抑制MMP3、c-Jun基因的表达相关.
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携带治疗基因的增殖型腺病毒CNHK300-m干扰素-γ的构建
目的 研制出一种携带抗癌基因的选择增殖型腺病毒载体系统.方法 克隆鼠干扰素(IFN)-γ基因序列,利用分子克隆技术将其插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中,得到腺病毒载体质粒pSG300-m IFN-γ.通过pSG300-m IFN-γ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK300-mIFN-γ.扩增、纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度.通过病毒增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力,通过Western blot检测腺病毒蛋白的表达,通过双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组病毒在不同细胞及不同时相的mIFN-γ表达量.结果 成功构建了携带治疗基因的增殖型腺病毒CNHK300-mIFN-γ,病毒滴度为1.0×109 pfu/ml,增殖实验证实CNHK300-mIFN-γ可以选择性地在端粒酶阳性肿瘤中增殖,Western blot分析结果显示腺病毒的E1A蛋白选择性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达,ELISA显示CNHK300-mIFN-γ感染端粒酶阳性肿瘤后有大量mIFN-γ的表达,并随着感染的时间表达量也相应上升.结论 CNHK300-mIFN-γ为肿瘤的生物治疗提供了一种新的策略.
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肝癌融合细胞疫苗的快速制备
目的 用48 h快速培养获得的成熟树突细胞与肝癌细胞系HCCLM3构建融合细胞疫苗.方法 用CD14正选磁珠从外周血中分离出CD14+细胞,加入含有GM-CSF和IL-4的树突细胞完全培养基培养24 h,再加入肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-6和PGE2,继续培养24 h获得树突细胞并检测免疫分子CD80、CD86、CD83和HLA-DR的表达.用50%聚乙二醇+10%二甲基亚砜融合HCCLM3与所获树突细胞构建融合细胞并检测其免疫分子的表达.自体T细胞增殖实验按照刺激细胞不同分为融合细胞组(RH)、树突细胞组(DC)、HCCLM3组(H)及树突细胞与HC-CLM3混合组(HH).结果 48 h培养获得成熟树突细胞的CD80、CD86、CD83和HLA-DR表达率可达94.43%、99.71%、62.78%和99.34%,它与HCCLM3构建的融合细胞同样表达此类免疫分子,并且对自体T细胞增殖的刺激作用更强(P＜0.05).结论 用48 h快速培养获得的树突细胞可以成功构建能有效刺激自体T细胞增殖反应的融合细胞,该方法优点显著.
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血吸虫病门脉高压小鼠肠系膜血管病变与肠源性内毒素血症的关系
目的 探讨血吸虫病门脉高压小鼠肠系膜血管病变,及其与肠源性内毒素血症之间的相互关系.方法 将40只健康小鼠随机分成正常对照组(N组)20只与模型组(M组)20只,M组采用腹部敷贴法制作血吸虫病模型,造模150 d后处死动物,鲎试验法测定血清内毒素水平;3色染色和超微电镜观察肠系膜静脉血管形态学改变;逆转录聚合酶链反应和Western blot方法检测肠系膜静脉血管中TLR-4、MD-2的表达.结果 M组血清内毒素水平高于N组(P＜0.01);形态学上M组肠系膜静脉血管出现明显的构型改变;M组小鼠肠系膜静脉血管TLR-4/MD-2表达水平高于N组(P＜0.01).结论 血吸虫病门脉高压时可发生明显的肠系膜血管病变;肠源性内毒素易位、TLR-4/MD-2信号通路的激活是导致肠系膜血管病变产生的原因之一.
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细胞分裂周期蛋白CDC25家族在人胰腺导管腺癌中的表达及意义
目的 探讨CDC25在胰腺导管腺癌(PDAC)中的表达及意义.方法 分别收集8例手术切除的人胰腺癌、慢性胰腺炎、正常胰腺以及肝和(/或)淋巴结转移组织,采用Affymetrix公司的GeneChip(R)HG-U95Av2 cDNA芯片初步筛查CDC25家族三个成员(CDC25A、B和C)在这些组织中的表达情况,然后通过定量PCR方法对基因芯片结果进行再验证分析.结果 基因芯片结果显示与慢性胰腺炎或正常胰腺组织比较,胰腺癌组织中CDC25B/mRNA的表达水平分别增加了1.4倍和1.9倍,而CDC25A和CDC25C mRNA水平在胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺组织中差异无统计学意义;定量PCR检测结果表明在胰腺癌组织中CDC25B/mRNA的平均表达水平分别比正常胰腺和慢性胰腺炎高7.5倍和3.9倍.结论 CDC25B在胰腺癌细胞周期调控中起着重要作用,可能参与了胰腺癌的发生、发展和演进过程,CDC25B有可能成为胰腺癌早期诊断和治疗的一个靶点.
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RNA干扰沉默蛋白激酶B基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响
目的 构建靶向蛋白激酶B(PKB/Akt)基因的逆转录病毒RNA干扰表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响.方法 针对大鼠PKB/Akt基因序列(NM_033230)设计多个短发夹环RNA(shRNA)序列,化学合成法合成单链寡核苷酸序列,pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLKIN,脂质体介导转染包装细胞PT67后获得PKB/Akt的重组逆转录病毒RNA干扰载体,感染血管平滑肌细胞(VSMC),Northern blot和Western blot法检测Akt及其下游底物-核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)等表达的变化,流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化,噻唑盐(MTT)比色法检测VSMC增殖活性的改变.结果 shRNA序列经T载体克隆,酶切确定该片段为PKB/Akt基因shRNA序列;感染VSMC,证实其能够显著抑制PKB/Akt的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期.结论 成功构建PKB/Akt基因逆转录病毒shRNA载体,感染VSMC能够明显抑制其分裂、分化和增殖.
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体外定点突变技术构建人促红细胞生成素基因表达载体
目的 构建人促红细胞生成素基因的真核表达载体并采用体外定点突变技术予以修正突变位点.方法 采用逆转录PCR方法从人肾组织克隆促红细胞生成素cDNA,亚克隆到真核表达载体并测序,采用体外定点突变技术将3个碱基突变位点予以纠正.结果 测序结果证实3个碱基突变位点得以纠正,得到序列完全正确的人红细胞生成素cDNA.结论 成功构建了人促红细胞生成素基因的真核表达载体,结合体外定点突变技术修复PCR产物中的突变是得到序列正确的目的 基因的较理想方法.
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VK2对肝癌细胞株MHCC97H的抑制作用
目的 观察VK2对MHCC97H细胞在生长、黏附、侵袭、凋亡以及Caspase-3活性的影响.方法 噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长;体外细胞黏附及侵袭实验检测细胞的黏附和侵袭能力;Annexin V-FITC Apoptosis Detection K和Caspase-3 Fluorescent Assay试剂盒分别检测细胞的凋亡及Caspase-3活性.结果 当VK2浓度从10-7mol/L增加到10-4mol/L时,细胞生长抑制率由12.5%增加到59.7%(P＜0.01).VK2对细胞的黏附抑制能力呈剂量依赖关系(P＜0.01);100μmol/L的VK2作用细胞3 h后,细胞对Fibronectin黏附抑制率为69.9%.作用48 h后,细胞侵袭抑制率为65.5%(P＜0.01);作用6 h后,细胞凋亡率为(28.5±1.6)%,与此同时,细胞Caspase-3活性为(226.0±6.4),与对照组(92.0±5.8)比较差异有统计学意义(P＜0.01);预先加入Caspase-3抑制剂(Z-VAD-FMK)后,Caspase-3活性无明显变化90.0±4.3(P＞0.05).结论 VK2对体外培养的MHCC97H细胞具有抑制生长、抑制黏附、抑制侵袭和诱导凋亡作用;Caspase-3参与了细胞凋亡的调控.
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TRAIL联合顺铂诱导肝癌细胞HepG2凋亡的研究
目的 探讨顺铂增加TRAIL诱导肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制,提供TRAIL应用肝癌临床治疗的一种新的用药模式.方法 以肝癌细胞HepG2为研究对象,应用流式细胞仪分析顺铂联合应用TRAIL对细胞周期的影响,Western blot检测顺铂作用前后HepG2细胞在TRAIL诱导凋亡过程中Caspase-8、Caspase-3、DR4、DR5、DcR1、c-FLIP及RIP的表达变化.结果 顺铂能够增强TRAIL诱导HepG2细胞凋亡的能力,两者联合应用具有明显的协同作用,顺铂预先处理能够下调c-FLIP及RIP的表达及增加DR5的表达.结论 TRAIL联合顺铂可以诱导肝癌细胞HepG2凋亡,其机制是通过下调c-FLIP及RIP的表达,解除Caspase-8受抑,恢复凋亡信号的传导来实现的.死亡受体DR5的表达上调也可能参与了这一变化过程.
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食管癌中p75NTR阳性细胞池的变化与顺铂耐药机制的研究
目的 探讨食管癌中p75NTR阳性细胞池的变化与顺铂耐药间的关系.方法 采用流式细胞技术检测未处理组和顺铂作用组的不同时间点5株食管癌细胞中p75NTR阳性细胞池的变化情况.随后,用免疫磁珠方法将食管癌细胞分为p75NTR阳性细胞池和阴性细胞池,观察p75NTR阳性细胞池的分化情况、检测顺铂作用2 d后食管癌细胞的凋亡率.结果 未加药的食管癌细胞中p75NTR阳性细胞池的比例一直维持恒定,但是在顺铂作用下,5株食管癌细胞中p75NTR阳性细胞池的比例均有明显上升.在分化实验中可观察到p75NTR阳性细胞可生成p75NTR阳性和阴性细胞;顺铂作用下,p75NTR阳性细胞池的凋亡率明显低于p75NTR阴性细胞池.结论 p75NTR阳性细胞池的自我分化和耐药性符合肿瘤干细胞的特征.
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血小板源生长因子对肝星状细胞增殖与Ⅰ型胶原合成的影响
目的 观察PDGF-BB对HSC细胞增殖以及合成Ⅰ型胶原的作用.方法 大鼠的HSC细胞用不同浓度的PDGF-BB培养处理,收集细胞和培养液上清.细胞增殖用噻唑蓝(MTT)法检测,流式细胞仪检测细胞周期,Ⅰ型胶原蛋白用ELISA法检测,RT-PCR法检测Ⅰ型胶原mRNA的表达.结果 PDGF-BB在浓度1～10 μg/L时呈剂量依赖性地促进HSC细胞增殖,当浓度大于10μg/L其促增殖作用达到饱和.PDGF-BB明显促进细胞的DNA的合成,使细胞大部分处于S期.PDGF-BB能在蛋白和mRNA水平上促进Ⅰ型胶原的合成,并且随着PDGF-BB处理时间地延长其合成量也增加.结论 PDGF-BB除了能促进肝星状细胞的增殖外,也促进Ⅰ型胶原的合成.
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反义Survivin对人结肠癌细胞凋亡及耐药性的影响
目的 观察Survivin ASODN联合长春新碱(VCR)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)对人结肠癌细胞系HT-29凋亡的影响.方法 设计合成特异性Survivin反义寡核苷酸(ASODN).HT-29细胞分成6组:空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、100、200、300 nmol/L反义链转染组.以阳离子脂质体为载体转染至HT-29细胞内,用Western blot法检测各组细胞Survivin蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;MTT法检测VCR、5-Fu对转染前后细胞的生长抑制情况.结果 各浓度ASODN转染组癌细胞Survivin蛋白表达有不同程度减少,而各对照组细胞Survivin蛋白表达无明显变化.各ASODN转染组VCR、5-Fu对肿瘤细胞生长抑制率明显高于各对照组(P＜0.05),且300 nmol/L转染组明显高于100和200 nmol/L组(P＜0.05).ASODN转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组(P＜0.05),以300 nmol/L转染组加VCR作用后凋亡指数高(P＜0.01).结论 Survivin ASODN转染人结肠癌细胞能下调Survivin蛋白的表达,诱导结肠癌细胞凋亡,抑制细胞增值,增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性.
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骨髓基质干细胞分化来源肝细胞移植的细胞准备及组织学观察
目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞向肝细胞分化后体外标记方法及移植肝细胞的肝内组织学表现.方法 分离大鼠骨髓基质细胞,在体外诱导分化为成熟肝细胞.将5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入后的肝细胞移植入已行部分肝切除大鼠体内,分别应用免疫组织化学和免疫荧光方法观察受体肝脏内移植细胞的形态和功能.结果 分化成熟肝细胞在BrdU掺入培养后细胞核染色可见特异性棕褐色标记;肝细胞移植后肝组织切片BrdU染色可定位移植细胞;白蛋白抗体染色显示移植细胞具有功能活性.结论 骨髓基质干细胞分化来源的肝细胞移植后形态功能稳定,是进行肝细胞移植的理想细胞来源.
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大鼠脊髓横断性损伤后细胞周期蛋白D3的表达变化
目的 探讨细胞周期蛋白D3(Cyclin D3)在横断性脊髓损伤(tSCI)后的表达变化以及定位情况.方法 将48只成年SD大鼠随机分为8组:正常对照组,T9横断伤2、8 h、1、3、5、7和14 d组,每组6只.采用Western blo测定损伤后各时间段Cyclin D3蛋白水平在脊髓中的表达变化.采用免疫组织化学方法检测Cyclin D3在正常以及损伤后脊髓中的分布和定位.结果 Western blot显示,Ccylin D3蛋白水平在tSCI后头、尾段均呈现先升高后下降的趋势,尾段明显:CyclinD3的表达于损伤后8 h开始逐渐升高,3d达到高峰,一直持续到第5天,之后逐渐下降.免疫组织化学表明Cyclin D3在正常脊髓中均匀分布,损伤后3 d,Cyclin D3在脊髓白质和灰质中表达明显增强;免疫荧光双标记表明Cyclin D3与神经元的标记物neuronal nucleus(NeuN)、少突胶质细胞标记物cyclic nucleotide 3'phosphohydrolase(CNPase)有明显共定位,与星形胶质细胞标记物glial fibrillary acrdic protein(GFAP)和小胶质细胞标记物OX-42也存在部分共定位.结论 脊髓损伤后Cyclin D3蛋白水平呈现明显的时相变化,并且与神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞存在共定位,提示Cyclin D3参与了脊髓损伤后的病理生理过程.
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胰腺癌患者外周血CD4-CD8-T细胞的检测及其临床意义
目的 研究胰腺癌患者外周血CD4-CD8-T细胞含量,并探讨其含量与肿瘤的临床病理类型及临床分期的相关性.方法 应用流式细胞仪分析胰腺癌患者和健康对照组外周血中CD4-CD8-T细胞含量.结果 20例胰腺癌患者CD4-CD8-T细胞占CD3+T细胞的比例为(4.13±1.81)%;20例健康对照组CD4-CD8-T细胞占CD3+T细胞的比例为(6.39±1.83)%,两组之间差异有统计学意义(P＜0.01).高、中分化的胰腺癌患者CD4-CD8-T细胞占CD3+T细胞的比例为(4.41±1.66)%;低分化胰腺癌患者CD4-CD8-T细胞占CD3+T细胞比例为(4.18±2.32)%,两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌患者CD4-CD8-T细胞占CD3+T细胞的比例为(2.96±1.50)%;Ⅰ、Ⅱ期胰腺癌患者CD4-CD8-T细胞占CD3+T细胞的比例为(5.09±1.50)%,两组之间差异有统计学意义(P＜0.01).结论 CD4-CD8-T细胞在胰腺癌中低表达,可能促进胰腺癌进一步发生发展.
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依那普利对肝硬化大鼠肝脏Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达的影响及与肝纤维化的关系
目的 探讨血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)依那普利是否对CCl4引起的大鼠肝纤维化有阻滞作用.方法 采用CCl4损伤引起的肝硬化门脉高压大鼠模型,随机分为正常对照组、肝硬化模型组、依那普利治疗组.治疗组在用CCl4造模的同时用依那普利灌胃,1次/d,直到造模结束,取部分肝组织用甲醛固定后行苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色并进行肝硬化分级;然后根据染色结果制作组织芯片并行免疫组织化学染色,检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达并进行半定量分析.取部分肝组织用逆转录(RT-PCR)法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达并进行半定量分析.结果 肝硬化分级和Masson染色胶原半定量结果证实肝硬化模型组、依那普利治疗组大鼠肝纤维化程度明显加重,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);而依那普利治疗组的肝纤维化程度较模型组明显减轻,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学蛋白表达及mRNA表达结果证实肝硬化模型组与对照组、依那普利治疗组比较明显上调(P＜0.05).结论 ACEI可以有效地下调CCl4引起的肝纤维化大鼠的Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白表达和mRNA表达,进而抑制大鼠肝纤维化的发展.
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肝癌肝移植术后复发转移相关分子的定量蛋白质组学研究
目的 筛查肝癌肝移植术后转移复发关键分子.方法 取具有相同疾病背景肝癌肝移植患者原发瘤标本,根据临床随访资料,分为复发和未复发组(各取6例).激光显微切割分别从原发瘤标本肿瘤组织中切取同质肝肿瘤细胞,提取总蛋白,按组别等量混合蛋白后,分别进行稳定同位素轻重链标记,2D-LC-MS/MS鉴定差异蛋白;免疫组织化学及免疫印迹验证选取的差异蛋白.结果 质谱鉴定出149个有定量信息蛋白,其中表达上调2倍以上蛋白29个,表达下调2倍以上蛋白共23个.利用免疫组织化学和蛋白免疫印迹对其中上调差异蛋白Capn4进行了验证,验证结果和质谱鉴定的结果相吻合.结论 肝癌肝移植术后转移复发与多种蛋白表达改变相关,其中Capn4高表达可能在复发转移中发挥作用,可能作为肝癌肝移植术后转移复发潜在的分子靶标.
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Survivin在原发性肝细胞癌中的表达及其与侵袭、转移的关系
目的 研究Survivin基因在原发性肝细胞癌中的表达水平及其与肝癌侵袭转移的相关性.方法 收集4种肝细胞癌细胞株,35例原发性肝癌组织标本及相应的癌旁组织,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Survivin mRNA转录情况;Western blot法检测Survivin蛋白表达.结果 在mRNA水平4株肝癌细胞株随侵袭转移能力升高Survivin表达依次升高(P＜0.01),HC-CLM6细胞株中Survivin表达水平高.肝癌组织Survivin mRNA表达均为阳性,而癌旁组织内无一例阳性表达,Survivin mRNA的表达水平在肝内转移组(1.082±0.213)显著高于肝内无转移组(0.799±0.324,P＜0.05).Western blot的结果与RT-PCR结果一致,肝内转移组Survivin蛋白表达(0.892±0.198)显著高于肝内无转移组(0.342±0.237,P＜0.05).结论 Survivin在原发性肝细胞癌中表达,且与侵袭转移等肿瘤的恶性生物学行为有关,Survivin基因高表达可作为判断HCC侵袭性和进展的一个潜在重要指标.
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磁性微球靶向栓塞食道/胃底曲张静脉的佳条件优选
目的 研究聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球(简称微球)靶向栓塞食道/胃底曲张静脉的佳条件,提高栓塞效果.方法 通过犬的脾门静脉网的靶向栓塞实验获得佳磁场强度和佳磁控时间;以不同粒径的微球靶向栓塞模型犬的食道/胃底曲张静脉,通过病理检查、胃镜、门脉造影评价栓塞效果,优选佳微球粒径.结果 佳磁场强度为0.4 T;佳磁控时间为30 min;佳微球粒径是30～50 μm和60～100 μm.结论 以本实验所获条件进行靶向栓塞,效果佳.
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白细胞介素-2基因转染联合特异性细胞毒性T淋巴细胞对裸鼠肝癌的影响
目的 观察白细胞介素-2(IL-2)基因转染联合特异性细胞毒性T淋巴细胞(sCTL)治疗裸鼠肝癌的疗效.方法 荷肝癌裸鼠6只,随机分为pORF-hIL-2质粒转染实验组和对照组,检测血浆白细胞介素(IL)-2的浓度.荷肝癌裸鼠24只,随机分成对照组、IL-2基因治疗组、sCTL治疗组和IL-2基因联合sCTL治疗组,观察肿瘤体积变化及生存时间.结果 实验组血清IL-2浓度在转染后第3天到达顶峰135.3 ng/L,持续15 d,对照组检测不到IL-2;各组肿瘤体积(治疗15 d后)变化为(262.27±78.30)、(151.65±63.93)、(27.16±27.69)、(-63.32±16.92)mm3;中位生存时间20、27.5、60、90 d;差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 联合应用IL-2基因转染和sCTL细胞治疗裸鼠的HepG2移植瘤,可以明显地提高抗瘤效应,表现协同增效作用.
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针对K-ras基因点突变的反义寡核苷酸对人胰腺癌Patu 8988细胞的抑制作用
目的 检测人胰腺癌Patu 8988细胞K-ras基因点突变形式,并观察针对该点突变的硫代反义寡核苷酸在体内外对Patu 8988细胞增殖和凋亡的影响.方法 顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法和基因测序检测Patu 8988细胞K-ras点突变形式,根据点突变形式设计并合成硫代反义寡核苷酸(K-ras mutation ASODN)作用Patu 8988,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况;流式细胞术(FCM)检测K-ras蛋白表达和细胞凋亡;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测K-ras mRNA表达水平;以Patu 8988细胞建立裸鼠胰腺癌模型观察K-ras mutation ASODN在体内的抗肿瘤效果.结果 PCR-SSP法和基因测序检测表明Patu 8988细胞存在K-ras基因第12密码子点突变,其突变方式为GGT→GTT.体外实验表明K-ras mutation ASODN组较正义寡核苷酸(SODN)组、随机寡核苷酸(RODN)组和空白对照组可明显抑制Patu 8988细胞生长(P＜0.01),并呈时间-剂量效应关系;转染48 h后,K-ras mutation ASODN组的K-ras蛋白和mRNA表达程度较SODN组、RODN组和对照组均明显降低(P＜0.01),而细胞凋亡明显增多(P＜0.05).体内实验表明K-ras mutation ASODN较SODN组、RODN组和对照组能有效抑制BALB/C裸鼠人胰腺癌的生长(P＜0.01).结论 针对K-ras基因第12密码子点突变的反义寡核苷酸可明显抑制人胰腺癌Patu8988细胞生长,促进细胞凋亡,其机制可能是通过下调K-ras蛋白和K-ras mRNA表达而起作用.
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153Sm-聚氨基葡糖的标记及其在小鼠体内的分布
目的 建立153Sm标记聚氨基葡糖的方法,观察其通过尾静脉及肝间质内注射给药后在小鼠体内的生物分布,为进一步用于肿瘤治疗奠定基础.方法 将153Sm2O3与盐酸在适当的条件下制备成153SmCl3,然后与聚氨基葡糖螯合生成153Sm-CHICO(153Sm-聚氨基葡糖复合物).昆明种小鼠90只随机分为3组.1、2组小鼠分别经肝间质注射等活度的153Sm-CHICO和153SmCl3,3组小鼠经尾静脉注射153Sm-CHICO,剂量为6.1 MBq/0.05 ml,分别于给药后0.5、1、2、6、24及48 h各组处死5只,取血及主要脏器测定放射性计数率值,计算每克组织的百分注射剂量率(%ID/g),每组各时间点取1只小鼠行SPECT显像.结果 153Sm-CHICO的标记率为(95.6±2.7)%,48 h放化纯为(89.6±1.9)%.1组小鼠肝间质注射153Sm-CHICO放射性核素主要浓聚于穿刺点,仅有少量分布于注射点外肝脏、肾脏、脾脏、骨等组织器官.1组小鼠肝间质注射点区(直径5mm)在48 h百分注射剂量率均值为27.16%ID/g,为2组注射点的139倍,为3组肝组织百分注射剂量率值的131倍.2组和3组小鼠血2 h的放射性活度为1组130倍以上,且血中放射性计数在较短时间内快速下降.结论 153Sm-CHICO标记方法简单、可行,具有较高的标记率及较好的稳定性.肝间质注射的153Sm-CHICO较长时间滞留在注射部位局部较小范围,在注射点以外组织和器官分布较少,血液清除快,153Sm-CHICO可能成为肿瘤核素内照射治疗的一种新药.
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短发夹RNA/MDR1逆转肝细胞癌多药耐药
目的 探讨短发夹RNA/MDR1(shRNA/MDR1)干扰技术能否体内逆转肝细胞癌多药耐药.方法 建立肝细胞癌耐药细胞株HepG2/MDR1和敏感细胞株HepG2裸鼠移植瘤模型,分腹腔注射组和瘤体内注射组,以表达载体pSUPER-shRNA/MDR1转染,阴性对照组以阴性载体pSUPER转染,72 h后行腹腔内阿霉素化疗试验,每周2次,共2周,然后处死动物,测量化疗前后肿瘤体积差,瘤体制成细胞悬液和组织切片,分别以流式细胞术和免疫组织化学检测细胞膜P-gp表达.结果 成瘤率100%,HepG2/MDR1组和HepG2组成瘤时间和化疗前肿瘤体积差异无统计学意义,HepG2/MDR1组化疗前后肿瘤体积差(mm3)与阴性对照组比较差异有统计学意义(700.14±25.61比1659.70±152.54,P＜0.01);腹腔注射组和瘤内注射组差异无统计学意义.流式细胞术检测发现治疗组细胞膜蛋白P-gp表达率(%)较阴性对照组明显下调(65.1%比94.1%,P＜0.05),腹腔注射组和瘤内注射组差异无统计学意义(94.1%比92.8%,P＞0.05).瘤体组织病理切片和免疫组织化学分析也有同样的结果.结论 表达载体pSUPER-shRNA/MDR1体内转染可以逆转肝细胞癌多药耐药.
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膀胱癌中受体酪氨酸激酶EphA2的表达及其意义
目的 探讨EphA2在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测49例BTCC及10例癌旁正常组织中EphA2的蛋白表达,应用实时定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)法检测各临床标本相应的mRNA表达并通过2-△△CT方法分析相对基因表达的差异.结果 相对于癌旁正常组织而言,EphA2在BTCC中的蛋白表达显著增强(积分吸光度IA均值:正常组8364±3915,癌症组19 122±5696,P＜0.01),其mRNA表达平均上调约2.57倍;除中分化(G2)与低分化(G3)组间EphA2 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)外,EphA2在其余各分级与分期组间的蛋白及核酸表达,差异均具有统计学意义(P＜0.05);EphA2的表达与膀胱癌的临床病理特征密切相关.结论 EphA2表达增强可能促进了膀胱癌的恶性晋级,EphA2可作为监测膀胱癌恶性发展的指标和治疗的新靶点.
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氯胺酮对骨癌痛模型大鼠脊髓信号传导子与转录激活子STAT3表达的影响
目的 观察腹腔注射氯胺酮对骨癌痛模型大鼠腰段脊髓背角STAT3表达的影响.方法 选择成年雌性SD大鼠24只,体质量180～220 g,随机分为4组(n=6):A组(对照组):左侧胫骨上段骨髓腔注入3 μl Hank液;B组(模型组):左侧胫骨上段骨髓腔注3 μl MADB-106大鼠乳腺癌细胞(4.8×109/L);C组(氯胺酮10 mg/kg体重);D组(氯胺酮20 mg/kg体重);C,D二组造模同B组.从第14天开始,A,B组大鼠腹腔分别注射生理盐水1 ml,C,D组大鼠腹腔分别注射氯胺酮10mg/kg体重(1 ml)及20mg/kg体重(1 ml),1次/d,连续4 d.术前及术后1～22 d,各组大鼠隔日观察辐射热痛阈值变化.第22天,取大鼠脊髓L4～6节段,采用免疫组织化学方法观察脊髓背角STAT3的表达.结果 A组大鼠对辐射热痛刺激的缩爪阈值在术后各时间点组内比较差异无统计学意义;术后14～22 d,与A组大鼠对辐射热痛刺激缩爪阈值比较,B、C组差异有统计学意义(P＜0.05),而D组比较差异无统计学意义(P＞0.05).大鼠腰脊髓背角Ⅰ～ⅣSTAT3免疫反应吸光度值B、C组与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),D组与A组比较差异无统计学意义.结论 腹腔注射20 mg/kg体重氯胺酮抑制了胫骨癌痛模型大鼠患侧腰段脊髓背角STAT3表达,NMDA/STAT3信号通路的激活参与了骨癌痛的维持.
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环氧氯丙烷处理对瓣膜组织结构及表面性状的影响
目的 通过研究环氧氯丙烷(ECH)处理对瓣膜组织结构及表面性状的影响,探究ECH处理生物瓣膜后防钙化的机制.方法 通过测定ECH处理瓣膜组织的抗酶消化能力、茚三酮值、热皱缩温度,以及血浆蛋白吸附实验、血小板黏附实验评价ECH处理瓣膜组织的表面性状.结果 经ECH处理后,抗酶消化能力增加,茚三酮值下降,热皱缩温度升高(P＜0.01),且对血浆蛋白和血小板的黏附减少,表面性状改善.结论 ECH处理能够增加瓣膜组织的交联,且改善瓣膜的表面性状,是ECH处理瓣膜组织防钙化、防衰坏的机制之一.
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放射后肝癌细胞MMP-2表达、活性的变化及其对侵袭性的影响
目的 探讨放射后肝癌细胞侵袭潜能的变化及其机制.方法 以不同剂量(0、4、8Gy)高能X线照射人肝癌低转移潜能细胞株MHCC97L.明胶酶谱法检测放射后24、48、72、96 h细胞培养上清液金属蛋白酶(MMP)-2活性,细胞免疫荧光法检测放射后24、48和72 h细胞内MMP-2蛋白表达,Transwell法测定放射后48和96 h细胞的侵袭能力.结果 放射后细胞MMP-2蛋白分泌及活性增强并与放射剂量及时间相关,8 Gy放射后48 h MMP-2蛋白活性高,达到对照组的2倍.0、4、8 Gy放射后48 h穿过transwell小室的细胞数分别为7.2±1.9、13.2±2.7和31.2±7.2(P＜0.05),放射后96 h组间差异无统计学意义.结论 放射后肝癌细胞侵袭潜能短暂增强,放射诱导细胞MMP-2分泌及活性增强是侵袭性增强的原因之一.
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缺氧诱导因子-1αsiRNA增强耐药肝癌细胞的化疗敏感性
目的 观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)特异性小分子干扰RNA(siRNA)对肝癌化疗的增敏作用.方法 构建HIF-1αsiRNA真核表达质粒,经脂质体稳定转染于耐药的C28肝癌细胞.研究分为实验组、阴性对照组和空白对照组.荧光定量PCR和Western blot技术分别检测3组细胞中多药耐药相关基因MDR1、LRP、MRP1在mRNA和蛋白水平的表达,PI法流式细胞术分析3组细胞在受到5-Fu作用后的凋亡指数.每组细胞分别随机注入10只裸鼠皮下,比较3组细胞成瘤后对ADM治疗的反应性.结果 HIF-1αsiRNA能有效抑制HIF-1α基因的表达,并能使C28耐药肝癌细胞内MDR1、MRP1、LRP基因在mRNA和蛋白水平表达明显下降.在5-Fu作用后第24、48、72小时,实验组细胞的凋亡指数分别是阴性对照组的2.88、3.56和3.87倍,实验组对化疗药物5-Fu的敏感性显著增强(P＜0.01).注射阿霉素后,实验组裸鼠皮下的耐药肝癌瘤体明显缩小,肿瘤抑制率为41.35%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 成功构建了HIF-1α-siRNA的真核表达质粒.HIF-1α靶序列特异性的siRNA可增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性,它与传统化疗药物的联合应用可望实现对肝癌的有效治疗.
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丙氨酰-谷氨酰胺双肽对肿瘤术后患者热休克蛋白70及肿瘤坏死因子的影响
目的 观察丙氨酰-谷氨酰胺双肽对肿瘤手术患者热休克蛋白、炎症反应及免疫状态的影响.方法 接受胸、腹部肿瘤切除手术患者116例进入研究,采用双盲设计,研究组58例接受丙氨酰-谷氨酰胺双肽补充的全胃肠外营养,对照组58例接受一般全胃肠外营养.7 d后观察热休克蛋白(HSP)-70、肿瘤坏死因子(TNF)-α及CD4/CD8变化.结果 两组患者研究期间均未出现死亡及过敏等副反应,丙氨酰-谷氨酰胺组7 d后TNF-α明显降低,CD4/CD8比率明显增多,HSP-70表达明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05);而对照组7 d前后无明显变化.结论 肿瘤手术患者术后使用丙氨酰-谷氨酰胺能增加HSP-70表达,减轻患者炎症反应,并改善患者免疫功能状态,对患者恢复有益.
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瘦素对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响及其作用机制探讨
目的 观察瘦素对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖的影响,探讨其作用机制.方法 免疫荧光检测人乳腺癌细胞系MCF-7瘦素受体(OB-Rb)的表达.于MCF-7细胞中分别加入不同浓度的瘦素(0、10、50、100、150μg/L),作用不同的时间(6、12、24 h),噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况,同法分别检测STAT3抑制剂AG490和ERK1/2抑制剂PD98059对瘦素刺激MCF-7细胞增殖的影响.采用免疫印迹法(Western blot)检测瘦素(100μg/L)作用于MCF-7细胞不同时间(0、20、40、60 min)STAT3和ERK1/2的磷酸化水平.结果 免疫荧光检测证实MCF-7细胞存在瘦素受体(OB-Rb)表达.瘦素能明显促进MCF-7细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性,于100 μg/L瘦素作用24 h时增殖效应大,100μg/L组与150μg/L组差异无统计学意义(P＞0.05);不同浓度的AG490与PD98059均可明显抑制瘦素对MCF-7细胞的增殖,随着AG490与PD98059浓度增高,抑制作用逐渐增强;MCF-7细胞经100ng/ml瘦素处理后,随时间延长STAT3和ERK1/2磷酸化程度逐渐增高,且持续至少达60 min.结论 瘦素可能通过激活STAT3和ERK信号通路促进人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖.
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XIAP和Caspase-9在乳腺癌中的表达及其与细胞凋亡的关系
细胞凋亡调控的紊乱与细胞的恶性转变具有十分密切的关系.XIAP基因与肿瘤的的发生、发展密切相关[1].Caspase-9是内源性凋亡通路中关键蛋白酶,它的活化对于整个内源性凋亡通路的激活至关重要.我们应用免疫组织化学SP法检测XIAP和Caspase-9在乳腺癌中的表达情况,研究两者与乳腺癌凋亡和临床病理参数之间关系.
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125 I放射粒子组织间植入对裸鼠肝癌的治疗作用
125I放射粒子组织间植入近距离治疗是近年来发展起来的恶性肿瘤放射治疗新技术[1].本研究旨在探讨125I放射粒子组织间植入治疗肝癌的作用及可能机制.
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靶向血管内皮生长因子基因的短发夹状RNA对胃癌细胞的抑制作用
RNA干扰已成为当前肿瘤基因治疗的新策略[1],以前我们曾报道了靶向血管内皮生长因子(VEGF)短发夹RNA有效抑制胃癌细胞VEGF mRNA表达[2],本实验旨在探讨该载体在抑制了VEGFmRNA表达后,对人胃癌细胞体内外抑制作用.
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聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养的猪肝细胞移植对急性肝衰竭大鼠肝再生的影响
我们将聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖乔(PLA-O-CMC)纳米粒子培养的猪肝细胞移植到急性肝衰竭(ALF)大鼠腹腔内,观察移植后血浆中肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)的变化及受体肝脏病理改变,探讨其对ALF大鼠肝再生的影响.
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可溶性CD40分子与EGFP融合基因的构建及在树突状细胞中的表达及功能鉴定
CD40与T细胞表面对应的配体CD154(CD40L)相互作用后,可以进一步刺激抗原提呈细胞,上调其CD80/CD86的表达,促进T细胞的活化[1].可溶性CD40蛋白(soluble CD40,sCD40)由CD40信号肽和胞外功能区构成,能够与膜表面CD40竞争性结合CD40L的功能区域.采用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)方法,成功地克隆了cDNA,并与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合,构建了真核表达载体pEGFP-N1/sCD40,并用脂质体法将其导入树突状细胞(DC)中进行表达,为有效利用树突状细胞诱导移植免疫耐受奠定了基础.
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冷洗涤法纯化培养Schwann细胞的研究
Schwann细胞(Sc)是周围神经系统主要的胶质细胞,为周围神经纤维行使功能和生存所必需.因其具有分泌多种生物活性物质、促进周围神经再生、修复中枢神经系统损伤等多种生物学效应,近年来一直是神经科学研究的热点.
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大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及其生长特性和表型
间充质干细胞(MSC)是一种具有多向分化、体外扩增、自我更新能力的细胞.本研究旨在分离rMSCs,并观察其类型特征及生长特性.一.材料和方法1.材料:SD大鼠(中山大学实验动物中心),DMEM-LG培养基(Gibico公司);胎牛血清(Hyclone公司);兔抗鼠CD-FITC(Pharmingen)
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胚胎干细胞源性肝卵圆细胞的体外研究
肝卵圆细胞对肝脏生长发育有重要意义[1,2].已建立的啮齿类动物肝卵圆细胞诱导实验模型使人们对啮齿类动物肝卵圆细胞的认识有了很大的提高[3],诱导过程烦琐耗时,显然不适用于人类.现将本研究结果报道如下
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比较不同胚胎时期神经干细胞的增殖、分化和凋亡
在中枢神经系统(CNS)发育过程中,神经干细胞(NSCs)通过对称分裂得到两个相同的具有增殖能力的子干细胞,而一小部分通过不对称分裂得到一个子干细胞和一个定向分化细胞[1,2],先后产生神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞[3].我们对大鼠胚胎脑皮质发育过程中3个非常重要时期(E14、E18和E20)的NSCs的增殖、分化和凋亡进行比较.
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过度膨胀性肺损伤与肺移植中肺保护的关系
肺移植后72 h内,常发生缺血-再灌注损伤,在研究肺缺血性损伤及再灌注损伤的基础上,形成了肺移植中的肺保护概念,追求理想的肺保护技术是肺移植领域的研究重点与热门[1].其中肺膨胀和肺保护之间的关系报道尚少,尤其在活体肺移植时由于供者肺叶与受者胸腔大小的差异,肺过度膨胀可导致术后严重威胁生命的通气和血流动力学障碍.
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草酸钙尿石患者VKDC结构域基因突变的研究
泌尿系结石以草酸钙结石为常见.现已发现尿液中存在一些大分子蛋白质与尿石形成相关,越来越多的研究证实尿凝血酶原片段1(UPTF1)是正常人尿草酸钙结晶的主要抑制因子之一.正常人体内的UPTF1借助其γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域发挥抑制草酸钙结石形成的作用.而这个功能结构域的羧化过程是以VitK依赖性羧化酶(VKDC)为关键酶催化完成的.早期研究证实,与正常人比较草酸钙结石患者肾脏组织VKDC活性明显降低,提示其在草酸钙结石形成中有重要意义[1].为探讨草酸钙结石患者肾脏VKDC活性降低的机制,本实验采用PCR-DHPLC(聚合酶链反应-变性高效液相色谱)及测序等方法对44例草酸钙结石患者进行了研究.
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夏枯草提取物对尿草酸钙结石形成的抑制作用
中草药夏枯草水提取液在体外能明显抑制尿草酸钙晶体的生长和聚集[1,2].为了进一步明确夏枯草抑制尿草酸钙结石形成的活性成分及作用机制,我们对夏枯草提取物对尿草酸钙结石形成的影响进行了研究.
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PD142893诱导活化T细胞凋亡减轻大鼠肺移植急性排斥反应
T淋巴细胞在器官移植急性排斥反应中起核心作用,目前许多免疫抑制剂都是通过阻止T淋巴细胞的活化而发挥抗急性排斥效应的.本研究旨在探讨PD142893参与大鼠肺移植后对急性移植排斥反应的影响及对活化T细胞的作用.
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重组人红细胞生成素对大鼠心肌细胞凋亡的影响
心肌梗死后心肌细胞供血不足,产生缺氧损伤,伴随着血管再通,心梗局部再灌,又产生超氧损伤.我们在体外条件下,通过模拟心梗局部的环境变化,探讨重组人红细胞生成素(rHu-EPO)对心肌细胞的缺氧和超氧损伤是否具有保护作用.
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肿瘤的耐药基因和耐药基因治疗研究发展
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一种疾病,几乎任何组织、器官、细胞均可发生癌变.现已证实化学治疗对许多肿瘤有效,如乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、白血病等,但是化学药物对正常细胞及骨髓的抑制作用限制了化疗的应用及疗效.耐药基因的研究及耐药基因治疗的出现有望解决这一难题,使化疗达到满意的效果.现就近年来对耐药基因和耐药基因治疗的研究作一简要综述.
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草酸与草酸钙晶体损伤肾脏的机制研究进展
尿石症以肾结石多见,是一种严重影响人类健康的常见病和多发病,其中,80%以上的结石成分是草酸钙(CaOx)晶体.近年发现,暴露于高浓度草酸(Ox)或CaOx晶体的肾脏上皮细胞会产生活性氧簇(ROS),导致自身损伤,细胞损伤的程度与晶体的浓度和接触晶体的时间成正比,长时间暴露于高浓度的Ox、Ca-Ox之下甚至出现细胞凋亡、坏死[1-11].临床资料显示,ROS引起的氧化应激(OS)和肾脏上皮损伤与结石的形成有关联[12,13].上皮损伤是结石形成的关键因素,它促进晶体聚集、生长或黏附于上皮而滞留于肾脏;细胞损伤导致一些能够调节晶体结晶过程的物质生成减少或失效,终有利于肾结石的形成.
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退行性脊柱侧凸的流行病学研究进展
随着人口老龄化趋势及老年人生活方式的转变,退行性脊柱侧凸(DS)日益成为导致脊柱功能障碍、影响老年人的活动和生活质量的重要疾病[1,2].DS是骨骼成熟后伴随着脊柱的退行性改变而新出现的脊柱侧凸(de novo scoliosis),与由被忽视的原有脊柱侧凸的进展而来、或继发于脊柱器质性病变(如肿瘤、创伤骨折、结核等)等的脊柱侧凸不同[3-6].尽管被命名为"退行性",但迄今为止其病因仍然不明.随着研究的深入,近年来在DS的流行病学研究方面均取得一定进展,现对此做一综述.
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细胞移植示踪技术的研究进展
细胞移植替代疗法已成为现代医学中发展为迅速的领域之一,移植细胞在宿主体内的存活、增殖、迁移和分布也自然受到人们的极大关注.目前移植细胞的示踪方法可归纳为5类:(1)利用荧光染料标记细胞,如Hoechst33342/33258、DAPI、PKH26和DiI等;(2)改变细胞基因,使其表达特异性的标志物,如绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶等;(3)选用雄性供体和雌性宿主,利用Y染色体作为标志物;(4)用5-溴脱氧尿苷等胸腺嘧啶类似物来标记分裂细胞;(5)采用超顺磁氧化铁作为磁共振对比剂活体示踪移植细胞.近年来,上述细胞标记技术均有很大进展,特别是荧光染料、转基因标记、磁共振示踪三方面进展为迅速.
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微小RNA对肿瘤影响的研究进展
微小RNA(miRNA)是一组小的非编码调控RNA,长度为21～23个核苷酸,miRNAs在物种进化中相当保守,在植物、动物和真菌中发现的miRNAs都是受到细胞类型和分化阶段严格调控的,只在特定的组织和发育阶段表达[1].
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胆道外科实验研究的现状与展望
自1882年Langenbuch成功施行首例胆囊切除术以来,胆道外科已经取得了令人瞩目的进步.随着近年认识的提高,胆道作为一个器官,无论临床和实验研究越来越受到重视,胆石病和胆道肿瘤成为了胆道外科实验研究的两大主题.近年来,随着分子生物学、分子遗传学等基础学科的快速发展和学科间的相互渗透,胆道外科实验研究已在各领域取得了一系列重要成果.实验研究的不断深入将为解决胆道外科临床难题、提高疾病诊断和治疗水平奠定扎实的基础.
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浅谈实验外科的创新
临床外科的快速发展离不开实验外科的工作积累,临床外科的逐步完善与显露出的客观问题给实验外科提出新的要求.现代的外科医生必须具备一定的科研素质,不断开展创新研究才能适应学科发展的需要.
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胆道外科中应该重视的几个问题
胆道外科经过上百年的发展,取得了较大的成绩.在与其基本的两大疾病谱系-结石和肿瘤的斗争中,胆囊结石病无论诊断还是治疗几乎已经均在医生的掌控之中,但是按照现代医学的发展方向,还有更根本的问题没有得到足够的重视;另外一些疾病(例如肝内胆管结石、胆管癌、胆囊癌等)则在目前的胆道外科发展阶段治疗疗效仍然非常不理想;更有意思的是随着社会和医学的发展,胆道外科的疾病谱还处在一个快速变动的阶段.这些问题的解决大多需要通过实验研究来提供解决思路.因此,胆道外科的实验研究成为一个范围广阔、令人充满期待的领域.我们认为以下几个方面应该引起足够的重视.
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Ⅳ型胶原和基质金属蛋白酶-2、-9在胆囊癌血管生成拟态组织中的表达与意义
目的 探讨Ⅳ型胶原和基质金属蛋白酶-2(MMP2)、MMP9在胆囊癌血管生成拟态(VM)中的表达与意义.方法 74例胆囊癌、胆囊腺瘤和慢性胆囊炎各10例病理标本及资料,应用免疫组织化学Envision、SABC法测定上述病变组织Ⅳ型胶原和MMP2、MMP9表达,Kaplan-Meier生存曲线和Cox风险模型分析其与胆囊癌VM的相关性和临床意义.结果 (1)在VM(+)胆囊癌,Ⅳ型胶原表达明显低于、MMP2表达明显高于VM(-)胆囊癌(P＞0.01),MMP9则无差异.(2)Ⅳ型胶原与VM(+)胆囊癌分化程度负相关;MMP2、MMP9与VM(+)胆囊癌的Nevin晚期、侵犯浆膜、肝转移正相关,MMP2尚与VM(+)胆囊癌的低分化和淋巴结转移正相关.(3)Ⅳ型胶原阳性和MMP2、MMP9阴性VM(+)胆囊癌患者术后5年生存期明显短于VM(-)胆囊癌(P＜0.01;P＜0.05;P＜0.01),MMP2阳性VM(+)胆囊癌患者术后5年生存期亦明显短于VM(-)胆囊癌.VM、Ⅳ型胶原是影响胆囊癌患者预后的独立因素.结论 Ⅳ型胶原、MMP2分别与胆囊癌VM呈负、正相关,MMP9与胆囊癌VM无关;Ⅳ型胶原和MMP2可作为判断胆囊癌是否存在VM及VM胆囊癌预后的重要指标.
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肝细胞生长因子-Met通路在胆囊癌进展中的作用
目的 通过检测Met蛋白在胆囊癌组织中的表达和肝细胞生长因子(HGF)对胆囊癌细胞系生长、运动侵袭能力的影响来探讨SF/HGF-Met通路在胆囊癌进展中的作用.方法 免疫组织化学(En Vision二步法)检测Met在胆囊癌组织中表达,以慢性胆囊炎、胆囊腺瘤和肝移植供体胆囊标本为对照.采用噻唑蓝(MTT)比色法以及体外运动、侵袭实验观察不同浓度梯度的HGF和格尔德霉素(GA)对胆囊癌细胞生长和运动侵袭能力的影响.结果 Met在胆囊癌组织中表达+7.14%(3/42),++52.38%(22/42),+++40.48%(17/42),正常胆囊上皮和良性疾病胆囊上皮中正常胆囊和良性疾病-9.52%(2/21),+66.67%(14/21),++19.05%(4/21),+++4.76(1/21),在肿瘤组织中表达较强(P＜0.01).本次实验所设定的浓度HGF对胆囊癌细胞系的生长促进作用不明显.运动侵袭试验中HGF对GBC-SD细胞迁移运动侵袭能力有诱导作用,并呈剂量依赖效应.GA本身对胆囊癌细胞运动侵袭能力抑制作用不明显,但是可以抑制HGF对胆囊癌细胞运动侵袭能力的诱导作用,差异有统计意义.结论 本研究提示了Met过度表达与胆囊癌发展的相关性,HGF-Met通路的激活在胆囊癌进展过程中起了一定作用.GA类药物有望成为抑制胆囊癌转移的有效药物.
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原发性胆囊癌染色体比较基因组杂交分析
目的 探讨原发性胆囊癌组织中的基因组变化,寻找与胆囊癌相关的癌基因和抑癌基因的染色体候选区域.方法 采用比较基因组杂交方法(CGH)分析28例原发性胆囊癌组织基因组的不平衡即DNA的扩增和丢失.结果 胆囊癌常见的染色体扩增区域是7p、7q、8q、17q、5p、11q、1q;常见的缺失染色体为17p、9p、5q、6q、3p、15p、13p.结论 胆囊癌中存在多条染色体拷贝数的改变,7p、7q、8q和17p、9p等部位可能分别存在与胆囊癌密切相关的癌基因和抑癌基因.
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肝脏X受体对小鼠胆汁脂质成分与胆固醇代谢基因表达的影响
目的 通过激活小鼠肝脏X受体,观察胆汁脂质成分变化与胆固醇代谢相关基因的表达情况,观察肝脏X受体在胆石病发生中的作用.方法 C57BL小鼠18只,分为2组,分别管饲肝脏X受体激动剂T0901317和安慰剂.分析胆汁脂质成分.实时定量PCR法测定肝脏与腹腔巨噬细胞的胆固醇代谢相关基因mRNA表达量.结果 实验组胆汁胆固醇摩尔百分比较对照组升高89%.实验组肝脏组织Abcg5、Abcg8、Abca1与Srebp1表达显著高于对照组:Abcg5为2.96±0.55比1.10±0.22(P＜0.01);Abcg8为0.86±0.16比0.29±0.07(P＜0.01);Abca1为8.45±1.06比5.51±0.84(P＜0.05);Srebp1为14.08±3.18比3.06±0.74(P＜0.01).腹腔巨噬细胞Abca1表达实验组高于对照组(27.66±7.18比8.39±3.65,P＜0.05).结论 肝脏X受体激活使胆固醇逆转运增强,肝脏摄取的过多胆固醇通过胆汁清除,导致胆汁胆固醇含量升高,提示肝脏X受体在胆石病发生中有重要作用.
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反义SKP2对胆管癌细胞系QBC中p27kip1表达的影响
目的 通过S期激酶相关蛋白(SKP2)反义寡核苷酸(ASODN)阻断泛素-蛋白酶体降解途径,观察对胆管癌细胞QBC中SKP2和p27kip1表达的影响,探讨泛素-蛋白酶体途径在胆管癌发生发展中的作用.方法 SKP2反义寡核苷酸和胆管癌细胞QBC共培养,脂质体转染,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),Western blot法检测SKP2和p27kip1 mRNA和蛋白在QBC中的表达.结果 SKP2 ASODN作用于QBC后,SKP2在mRNA和蛋白的表达较对照组和NSODN组均显著降低(P＜0.05),p27kip1 mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05),蛋白表达则较对照组和NSODN组明显增高(P＜0.05).结论 SKP2介导的泛素-蛋白酶体途径在调节胆管癌细胞QBC中p27kip1的降解中发挥重要作用,SKP2反义寡核苷酸在显著抑制QBC中SKP2 mRNA和蛋白的表达的同时,促进p27kip1蛋白表达,但对p27kip1 mRNA无明显影响,提示SKP2对p27kip1的调节主要在转录后水平.SKP2作为胆管癌基因治疗中有效的潜在靶基因,在胆管癌的基因治疗方面具有重要意义.
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脱细胞胆管细胞外基质替代胆总管缺损的研究
目的 探讨脱细胞胆管细胞外基质(ECM)的制备方法及其替代胆总管缺损的可行性.方法 采用4因素3水平9次实验的正交设计[L9(34)],切取活体犬的肝外胆管39段,每段长1 cm,其中27段按正交设计随机分为9组行脱细胞处理,试验重复3次.采用苏木素-伊红(HE)染色及计算机图像分析对ECM进行残余细胞成分计数,进行极差分析及方差分析,获得制备ECM的佳方案.另12段胆管按佳方案制备成ECM并用于同种异体胆总管缺损修复实验.分别于术后2、4、12及24周取材观察缺损修复处组织再生情况.结果 脱细胞后第7、9组未发现残余细胞,ECM富含胶原,第9组胶原呈立体交叉交联.移植术后2周,ECM内膜面见少量单层上皮细胞,有血管长入其中,ECM中有少量成纤维和平滑肌细胞,吻合口处有较多炎性细胞浸润;4周ECM管腔被上皮细胞覆盖,排列整齐,ECM中有较多成纤维和少量平滑肌细胞,吻合口有少量炎性细胞浸润;12周吻合痕迹消失,ECM中有较多成纤维、平滑肌细胞和少量纤维细胞;24周ECM中有以平滑肌细胞和纤维细胞为主,少量成纤维细胞,结构近似正常.结论 制备ECM中3个关键条件的佳水平为A3B3C3,即在胆管脱细胞处理过程中采用0.4%胰蛋白酶、1.0%叠氮二苯基磷(DPPA)、40 U/ml DNA酶.所得ECM应用于犬同种异体胆总管端端吻合修补,效果满意.
| 年 | 期数 |
| 2019 | 01 02 |
| 2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 |
| 2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2006 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2005 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2004 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2003 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
| 2002 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2001 | 01 02 03 04 05 06 |
| 2000 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1999 | 01 02 03 04 05 06 |
| 1998 | 01 02 |
