中华实验外科杂志
Chinese Journal of Experimental Surgery 중화실험외과잡지
- 主管单位: 中国科学技术协会
- 主办单位: 中华医学会
- 影响因子: 0.75
- 审稿时间: 1-3个月
- 国际刊号: 1001-9030
- 国内刊号: 42-1213/R
- 论文标题 期刊级别 审稿状态
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羊膜移植联合碱性成纤维细胞生长因子滴眼液治疗兔角膜碱烧伤
目的 观察羊膜移植与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)滴眼液联合应用对兔角膜碱烧伤的治疗效果。方法 将60只新西兰白兔随机分为4组,分别为羊膜移植联合bFGF滴眼液点眼组(A组),羊膜移植组(B组),bFGF滴眼液点眼组(C组)及对照组(D组)。用1 mol/L NaOH烧伤兔右眼,术后2 ~28 d用裂隙灯显微镜观察角膜透明度,新生血管生长,角膜上皮修复及羊膜植片的变化。结果 所有烧伤角膜都能完全愈合,但在抑制炎症反应、抗新生血管的生长及角膜上皮修复等方面,羊膜移植联合bFGF滴眼液点眼组明显优于对照组,也好于其他两实验组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 羊膜移植联合bFGF滴眼液点眼对治疗角膜碱烧伤有良好效果。
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转化生长因子-β1诱导肝星状细胞间质上皮转化研究
目的 检测转化生长因子(TGF)-β1对肝星状细胞(HSCs)间质上皮转化的作用。方法 用人重组TGF-β1及其中和抗体孵育原代人肝星状细胞48 h,以Western blot检测肝星状细胞间质标记Vimentin、desmin和上皮标记CK18及白蛋白(Albumin)的表达,并分析其迁移能力和形态变化。结果 TGF-β1可显著下调肝星状细胞表达Vimentin和desmin,而使其表达CK18及Albumin,同时其迁移能力显著下降(3083±629,P<0.05),细胞形态由星芒状向铺路石样转化。在同时接受TGF-β1中和抗体孵育的肝星状细胞中,上述标记表达,迁移力(9250±1146,P>0.05)和形态变化不明显。结论 TGF-β1可显著诱导肝星状细胞向肝上皮细胞转化,提示其可能是肝细胞重要再生来源之一。
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乙型肝炎病毒X蛋白对卵圆细胞中Smad2、Smad3、Smad4基因表达的调控作用
目的 观察乙型肝炎病毒编码X蛋白(HBX)对肝脏卵圆细胞中转化生长因子-β(TGF-β)/Smad中核心元件Smad2、Smad3、Smad4表达的调控作用。方法 稳定转染HBX基因的大鼠卵圆细胞株HBX-EGFP-LE/6作为实验组,转染绿色荧光蛋白标记空载体的大鼠卵圆细胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圆细胞株LE/6作为对照组。Real-time聚合酶链反应(PCR)与Western blot分别检测3种细胞株中Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白表达。结果 对照组Smad3的mRNA表达量分别是实验组的(4.56±0.79)倍和(4.14±0.38)倍,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组Smad4的mRNA表达量分别是实验组的(1.41±0.04)倍和(1.63±0.43)倍,差异有统计学意义(P<0.01)。实验组Smad3蛋白表达水平有一定程度降低。结论 HBX可以在卵圆细胞中影响TGF-β/Smad信号通路中的核心元件Smad3的转录及蛋白合成,对Smad4的转录有一定影响。
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KiSS-1、黏蛋白1和上皮钙黏附蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系
目的 探讨KiSS-1、黏蛋白1(MUC1)和上皮钙黏附蛋白(E-cad)在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 应用免疫组织化学SP法检测106例乳腺癌组织中KiSS-1、MUC1和E-cad的表达,分析KiSS-1、MUC1和E-cad在癌组织表达的相关性及其与临床病理参数的关系。结果 KiSS-1、MUC1和E-cad在乳腺癌组织中的表达与淋巴结转移(N058.97%/38.46%/74.36%:N126.87%/61.19%/53.73%)和临床分期(Ⅰ和Ⅱ60.66%/39.34%/70.49%;Ⅲ和Ⅳ8.89%/71.11%/48.89%)有关(x2=10.715/5.112/4.422和29.259/10.487/5.095,P均<0.05),与患者年龄、绝经期、肿瘤T分期、M分期无明显相关(P值均>0.05)。伴随着淋巴结转移和临床分期的增加,乳腺癌组织中KiSS-1和E-cad的表达下调或缺失,MUC1的表达则升高。随着乳腺癌组织分化程度的降低,E-cad(高分化75.00%;中分化66.67%;低分化28.58%)的表达下调或缺失(x2=12.391,P<0.05),MUC1(高分化32.14%;中分化56.14%;低分化71.43%)的表达升高(x2=16.631,P<0.05)。乳腺癌组织中KiSS-1和MUC1的表达呈负相关(r=-0.714,P<0.05),和E-cad的表达呈正相关(r=0.763,P<0.05)。结论 KiSS-1、MUC1和E-cad的表达与乳腺癌临床分期和淋巴结的转移相关,其相互作用在乳腺癌细胞的黏附、侵袭和转移中起重要作用,KiSS-1可能作为一种肿瘤转移抑制蛋白发挥重要调节作用。
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不同比例自体微粒皮与异体脱细胞微粒真皮复合移植的研究
目的 观察阶梯比例自体微粒皮与异体脱细胞微粒真皮混合移植后创面的修复效果。方法 选雄性Wistar大鼠为移植供体,以60只雌性SD大鼠作为受体,制作全层皮肤创面,并按混合的比例不同分为混合皮A、B、C组、自体皮组(D组)、异体皮组(E组),移植扩张比为5:1。比较各组创而愈合率,微血管计数及基质金属蛋白酶(MMP)-1和MMP-2蛋白表达。结果 (1)移植后2、3周,混合皮组创面愈合效果明显高于D组和E组,混合皮组间B、C组创面愈合率(28.94±2.97)%、(30.62±1.94)%;(81.14±9.30)%、(88.00±5.71)%显著高于A组(28.36±2.11)%;(79.81±7.07)% (P <0.05),而且A组有明显脱屑现象。(2)移植后2、3周,混合皮各组微血管数目明显高于D组、E组(P<0.05);移植后2周混合皮组间A组微血管数目(30.00±1.83)明显少于B、C组( 34.30±1.70)、(35.10±1.79)。(3)MMP-1在创面形成后表达上调,而后下降,但混合皮组MMP-1的表达高于D组,尤以A、B组明显;MMP-2在移植后第3周达高峰,混合皮组表达高于D组(P<0.05)。结论 自体微粒皮与异体脱细胞微粒真皮移植扩张比为4:1时,达到促进创面愈合的佳比例,有利于微血管长入及MMP-1、2的适度表达。
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大鼠慢性皮肤溃疡创面愈合中转化生长因子-β1、胶原Ⅰ、胶原Ⅲ的蛋白表达
目的 观察大鼠慢性皮肤溃疡创面愈合过程中转化生长因子-β1( TGF-β1)、胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的蛋白表达。方法 将24只8周龄雌性Wister大鼠分为单纯创面组(A组)和皮瓣+创面组即缺血模型组(B组),每组各12只;苏木素-伊红(HE)染色法观察创面1、3、7、10d上皮化率、收缩率及中性粒细胞;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定创面1、3、7、10 d TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达。结果 A组上皮化率在各个时间段均高于B组,且在第7天差异有统计学意义(P<0.05)。A组收缩率明显低于B组。A组中性粒细胞第1、3天逐渐增加,第3天增加到多,随后逐渐减少;B组在1、3、7d出现增加趋势,第7天增加到多,第10天减少。TGF-31含量A组于术后1、3、7、10d呈曲线上升趋势,B组在术后1、3、7d逐渐减低,10 d较7d略有回升,且在第1天两组差异有统计学意义(P<0.05)。胶原Ⅰ蛋白的含量两组随着术后时间的延长均呈减少趋势,在第10天两组差异有统计学意义(P<0.05)。胶原Ⅲ蛋白的含量两组随术后时间的延长也呈减少的趋势,但在第3天A组比B组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 在缺血的干预因素作用下TGF-β1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达的减少可能延迟了慢性创伤的正常愈合。
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维生素K2对肝癌细胞株内的肝癌衍生生长因子表达的抑制作用
目的 检测维生素K2对肝癌细胞株内的肝癌衍生生长因子(HDGF)表达的作用。方法 半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测0、10、30μm维生素K2干预后肝癌细胞中HDGF的mRNA表达,Western blot法检测不同浓度维生素处理后的肝癌细胞中HDGF蛋白表达。结果 RT-PCR结果示96 h后10、30μm维生素K2干预组能呈剂量依赖性抑制肝癌细胞中HDGF的mRNA表达。Western blot法检测结果示96 h后的10、30 μm维生素K2干预组中HDGF的蛋白表达分别为无药对照组的(0.915±0.025)倍和(0.530±0.030)倍,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 维生素K2可下调肝癌细胞中的HDGF表达。
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miR-195对胃癌BCG823细胞株增殖与凋亡的影响
目的 观察miR-195对胃癌细胞BCG823增殖与凋亡的影响。方法 利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将miR-195的模拟物转染入BCG823细胞中。Real-time聚合酶链反应(PCR)法测定BCG823内miR-195的表达。CCK8法测定细胞生长曲线观察细胞增殖的抑制。流式细胞仪测定细胞凋亡率的变化。JC-1染色检测线粒体膜电位变化。Caspase活性检测试剂盒检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性。结果 对照组24、48、72h吸光值分别为0.214、0.236、0.510、0.702,而转染组24、48、72 h吸光值分别为0.222、0.224、0.330、0.504,转染组凋亡率为21.84%,较对照组(4.24%)显著增加,转染组线粒体电位4.3,较对照组(13.8)显著降低(P<0.05)。对照组Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8活性分别为0.265±0.029、0.652±0.042、0.244±0.047,而转染组Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8活性分别为0.504±0.039、0.214±0.037、0.262±0.032。miR-195能使Caspase-3、Caspase-9的活性增加,Caspase-8的活性无显著变化。结论 体外实验初步证明miR-195基因可抑制胃癌细胞株BCG823增殖并诱导其凋亡。
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人髓样细胞触发受体-1原核表达载体的构建和表达及多克隆抗体的制备
目的 构建人髓样细胞触发受体-1(TREM-1)原核表达载体使其表达并制备多克隆抗体。方法 采用特异性引物扩增人TREM-1胞外段cDNA,经酶切、连接、构建到原核表达载体pET28a(+),将构建的重组表达质粒转化入E.coli BL21( DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA 柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果 序列测定证实构建的重组表达载体pET28a(+)-TREM-1含有人TREM-1编码序列,其序列分析与Genbank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为21.80 kDa的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯,双向琼脂扩散法检测抗体效价为1:16,ELISA法检测抗体效价为1:25 600,Western blot分析显示抗体能特性结合人TREM-1重组蛋白。结论 成功构建高表达重组人TREM-1蛋白的原核表达载体及制备高效价兔抗人TREM-1多克隆抗体。
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Ⅰ型胶原凝胶包埋脂肪干细胞复合PLGA-β-TCP支架修复兔自体桡骨缺损
目的 采用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋兔脂肪干细胞并复合PLGA-β-TCP支架修复自体桡骨缺损。方法 使用Ⅰ型胶原凝胶悬浮兔脂肪干细胞并与PLGA-β-TCP复合构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(ASCs-COL/PLGA-β-TCP)(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(ASCs/PLGA-β-TCP)(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(COL/PLGA-β-TCP)(C组)、单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)以及空白缺损(E组)作为对照,体外成骨诱导培养2周后植入桡骨1.5cm缺损部位。30只兔(60侧)采用两因素随机区组设计每只兔两侧骨缺损植入组别。分别于术后8、16、24周处死兔,取材,进行相关分析。结果 术后8周,大体观察、放射学、组织学检测示A组桡骨断端连续性基本恢复。术后16周,A组骨断端连续性完全恢复,髓腔未通。术后24周,A组髓腔再通,改建塑形趋于完成,材料基本降解。自术后16~24周,A组残存材料比例低于其他3组(P<0.05,n=4);与A组比较,在整个观察周期内,B、C、D组均无明显成骨现象,E组保持骨缺损状态(P <0.05,n=4)。结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋脂肪干细胞进而与PLGA-3-TCP多孔支架材料复合构建新型仿生骨组织工程复合体,可修复兔桡骨1.5 cm缺损。
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MK-1抗原和再生基因蛋白Ⅳ在胆囊良恶性病变组织中的表达及其临床意义
目的 探讨胆囊良恶性病变组织中MK-1抗原(MK-1)和再生基因蛋白Ⅳ(RegⅣ)的表达水平及其临床病理意义。方法 108例胆囊腺癌、46例癌旁组织、15例腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎手术切除标本常规制作石蜡包埋切片,MK-1和RegⅣ染色方法均为EnVisionTM免疫组织化学方法。结果 胆囊腺癌MK-1和RegⅣ表达阳性率均明显高于癌旁组织(x2MK-1=18.76,P<0.01;x2RegⅣ=9.92,P<0.01)、腺瘤性息肉(x2MK-1=9.49,P<0.01;x2RegⅣ=8.59,P<0.01)和慢性胆囊炎(x2MK-1=24.11,P<0.01;x2RegⅣ=19.24,P<0.01);MK-1和RegⅣ表达阳性的良性病例的胆囊上皮均呈中至重度不典型增生。高分化、无淋巴结转移、未侵犯周围组织的病例MK-1表达阳性率明显高于低分化、淋巴结转移和侵犯周围组织的病例(P<0.05或P<0.01);高分化腺癌、无淋巴结转移和未侵犯周围组织的病例RegⅣ表达阳性率明显低于低分化腺癌、淋巴结转移和侵犯周围组织病例(P<0.05或P<0.01)。经Kaplan-Meier生存分析发现MK-1表达阳性病例术后生存期明显高于阴性表达病例(P<0.01),但RegⅣ表达阳性病例术后生存期明显低于阴性表达病例(P<0.01);Cox多变量回归分析显示,MK-1阴性表达和(或)RegⅣ阳性表达可反映胆囊腺癌预后不良。结论 MK-1和RegⅣ表达与胆囊腺癌发生、临床生物学行为及预后密切相关。
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正常髓核细胞的黏弹性研究
目的 观察正常髓核细胞的黏弹性。方法 髓核组织取材于3例脊柱侧凸矫形手术者术中取出废弃的髓核组织,用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化分离细胞,Ⅱ型胶原免疫荧光组化和蕃红染色进行细胞鉴定,测量细胞直径,采用微管吸吮技术分析髓核细胞的黏弹性特性。结果 髓核细胞直径为(15.40±1.83)μm,正常髓核细胞的黏弹性参数k1(0.101 ±0.052) kPn、k2(0.353±0.199) kPa和μ(3.034±1.843) kPa·s。直线相关性分析表明,仅k1与髓核细胞直径明显相关(r=-0.389,P<0.05)。结论 正常髓核细胞表现为典型的黏弹性固体蠕变特征;微管吸吮技术可以作为测量髓核细胞生物力学特性的可靠方法。
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DNA损伤修复酶hOGG1降低食管鳞癌细胞对H2O2和顺铂的敏感性
目的 观察食管鳞状上皮癌( ESCC)细胞中,DNA损伤修复酶人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶( hOGG1)的高表达,对该细胞H2O2氧化剂和化疗药物顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 构建重组腺病毒pAd-CMV5-DEST-hOGG1,并转染食管鳞癌细胞,建立高表达hOGG1的食管鳞癌细胞( EC9706-hOGG1)模型。H2O2和顺铂分别作用于转染重组腺病毒的EC9706细胞、转染空腺病毒EC9706细胞(EC9706-LACZ)以及未转染病毒EC9706( EC9706)细胞。用噻唑蓝(MTT)比色法和锥虫蓝染色法比较3种细胞的存活率,用8-羟基鸟嘌呤(8-oxoG)免疫组织化学比较3种细胞的氧化损伤程度,用TUNEL法和流式细胞仪(FCM)检测法比较3种细胞的凋亡。结果 高表达hOGG1的食管鳞癌细胞较两对照组细胞有更高的存活率、更低的8-oxoG氧化损伤程度和凋亡指数。用1000μmol/L H2O2作用1.5h后,用流式细胞仪检测,发现EC9706-hOGG1细胞较EC9706-LACZ及EC9706细胞凋亡减少。凋亡率为EC9706-hOGG1:5.50%,EC9706-LACZ:12.54%,EC9706:13.48%。用10 mg/L DDP作用1.5h后,发现EC9706-hOGG1细胞较EC9706-LACZ及EC9706细胞凋亡减少。凋亡率分别为EC9706-hOGGl:3.95%,EC9706-LACZ:11.59%,EC9706:11.48%。结论 食管鳞癌细胞中hOGG1蛋白高表达,可能会导致食管鳞癌细胞对氧化剂H2O2和化疗药物顺铂耐受。
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基质金属蛋白酶-9和色素上皮衍生因子在胰腺癌侵袭转移中的作用
目的 观察基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和色素上皮衍生因子(PEDF)基因表达在胰腺癌(PC)侵袭转移中的作用。方法 应用免疫组织化学法检测35例胰腺癌标本中癌细胞的MMP-9和PEDF的表达,统计分析两种分子标记物与胰腺癌细胞MMP-9和PEDF的表达。结果 胰腺癌组中MMP-9和PEDF表达率分别为71.4%和34.3%,MMP-9高表达率和PEDF低表达率与浸润范围、淋巴转移和远处转移呈正相关(P<0.05)。MMP-9与PEDF表达呈负相关(P<0.01)。结论 MMP-9在胰腺癌侵袭转移中起促进作用,PEDF可抑制肿瘤生长,PEDF低表达可能通过上调MMP-9的表达,从而促进胰腺癌的侵袭转移。
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靶向巨噬细胞移动抑制因子的siRNA对小鼠大肠癌肝转移的影响
目的 探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的小干扰RNA (siRNA)对BALB/C小鼠大肠癌肝转移的影响及其可能的机制。方法 盲肠造疝原位接种瘤块法建立BALB/C小鼠大肠癌肝转移模型。将成功建模的小鼠随机分为3组。分别每周2次肿瘤原位注射相同体积的靶向MIF的siRNA( MIF siRNA,0.15 ng/kg)、非特异性siRNA( NS-siRNA,0.15 ng/kg)及生理盐水(NS,0.15 ng/kg),治疗4周。治疗结束3d后,处死小鼠。肝脏连续切片,苏木素-伊红(HE)染色观察各组大肠癌肝转移;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清MIF及血管内皮生长因子(VEGF)浓度;免疫组织化学染色检测肝转移灶微血管密度(MVD)。结果 MIF siRNA组、NS-siRNAR组及NS组的大肠癌肝转移率分别为10%、60%与70%(x2=8.30,P<0.05),小鼠血清MIF分别为(20±4)、(72±8)与(78 ±7) ng/L(P <0.05);小鼠血清VEGF分别为(20±4)、(77±9)与(77±10) ng/L(P<0.05);肝转移灶的MVD分别为19±3、29 ±6与35±7(P<0.05)。结论 靶向MIF的siRNA降低了小鼠大肠癌肝转移的发生率,其机制可能是靶向MIF的siRNA抑制了MIF表达,下调VEGF的表达,减少了MVD。
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封闭乳腺癌转移抑制基因1的表达可抑制乳腺癌细胞MCF-7的转移
目的 构建乳腺癌中乳腺癌转移抑制基因1( BRMS1)反义基因重组腺病毒载体,并观察其对乳腺癌细胞MCF-7转移能力的影响。方法 应用基因重组技术将BRMS1反义基因构建于腺病毒载体pAD-X,转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒,并用real-time聚合酶链反应(PCR)进行BRMS1基因表达的验证。将重组腺病毒pAD-aBRMS1感染MCF-7细胞后,应用Tran-°swell小室法观察对细胞侵袭和运动能力的影响。结果 酶切结果与预期相符,real-time PCR可检测到感染BRMS1反义基因重组腺病毒后MCF-7细胞没有BRMS1基因表达。病毒转染后Transwell 小室可见,MCF-7细胞的侵袭和运动能力均受到显著的抑制(P值均<0.01)。结论 重组反义BRMS1腺病毒载体正确构建,其对乳腺癌细胞MCF-7的侵袭和运动都有抑制作用。
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高压氧治疗小鼠急性胰腺炎
目的 观察高压氧(HBO)在小鼠急性胰腺炎中的作用。方法 建立胰腺炎小鼠模型,随机分为高压氧治疗组和对照组。高压氧治疗组中,小鼠模型建立6h后给予100%氧,2.5个大气压治疗90 min,之后每12h给予治疗1次。第7天处死存活的小鼠。进行胰腺炎的严重程度进行分级肉眼及镜下分析,计算肺的湿、干重来评价肺水肿。比较两组间的差异。结果 治疗组中肉眼及显微镜下的胰腺炎的严重程度评分8.2±0.8及9.5±0.3,明显低于对照组10.6±0.6及11.2±0.3(P<0.05)。治疗组胰腺坏死表现也明显较对照组减少,分别为(41±5)%及(55±5)%(P<0.01)。两组的肺水肿差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组7d存活率明显高于对照组,分别为(39±3)%和(26±1)%(P<0.05)。结论 高压氧治疗可以降低胰腺炎的坏死程度,提高重症急性胰腺炎的生存率。
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Ku80高表达对肝癌SMMC7721细胞凋亡的影响
目的 观察Ku80高表达对SMMC7721肝癌细胞凋亡的影响。方法 将Ku80基因转染到SMMC7721细胞;流式细胞术和TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白表达。结果 筛选获得稳定高表达Ku80的克隆细胞;流式检测显示,Ku80高表达克隆的凋亡率(9.44±1.52)%和(9.26±1.72)%与对照组(1.81±0.15)%和(1.83±0.25%)比较轻度增高,差异有统计学意义(P <0.05);TUNEL实验显示,Ku80高表达克隆形成裸鼠皮下瘤的凋亡率(9.3±2.0)%和(10.0±2.1)%与对照组(3.5±1.0)%和(3.6±1.1)%比较轻度增高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot检测显示,Ku80高表达克隆cleaved PARP-1、active Caspase-3和cleaved Caspase-9的表达与对照组比较明显增高,bcl-2的表达减低,而bax无变化。结论 体内外实验均证实Ku80高表达可引起SMMC7721细胞凋亡轻度增加。
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骨形态发生蛋白-2和转化生长因子-β1双基因共表达对骨髓基质细胞向软骨细胞分化基因表达的影响
目的 观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和转化生长因子-β1 (TGF-β1)双基因真核共表达载体对兔骨髓基质细胞(MSCs)向软骨细胞分化mRNA表达的影响。方法 pIRES-BMP-2-TGF-β1、pIREES-BMP-2 and pIRES-TGF-β1质粒通过质脂体介导转染MSCs,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测MSCs内Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达。结果 转染后2、4d双基因组MSCs内的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达量60.4±10.1、606.0±88.5和42.6±6.0、411.2±73.6均明显高于转染后单一BMP-2(28.7±4.0、236.7±48.5和26.9±4.3、208.2±36.7)及TGF-β1(30.9±4.54、205.5±38.7和28.4±3.7、184.9±30.9)组(P<0.05)。结论 pIRES-BMP-2-TGF-β1双基因真核共表达载体诱导MSCs向软骨细胞分化的作用强于单一基因BMP-2及TGF-β1。
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番茄红素促进前列腺癌LnCaP细胞早期凋亡
目的 观察类胡萝卜素中番茄红素对前列腺癌LnCaP细胞早期凋亡的影响。方法 采用磷脂结合蛋白荧光素标记法,结合流式细胞仪检测技术,分别测定不同浓度(0.5、5.0、10.0、15.0 μmol/L)番茄红素对前列腺癌LnCap细胞早期凋亡的影响,测量细胞早期凋亡的数目,比较不同浓度番茄红素与溶剂对照组早期凋亡细胞的差异。结果 加入不同浓度番茄红素的细胞组与溶剂对照组比较,LnCap细胞早期凋亡的比例分别是番茄红素组2.08%、1.10%、32.20%、9.61%,溶剂对照组0.65%、0.48%、13.10%、6.75%,可见加入番茄红素可使LnCap细胞早期凋亡率增加。结论 番茄红素有促进前列腺癌LnCaP细胞早期凋亡的作用。
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重组人骨形态发生蛋白-2对鼠雪旺细胞增殖及生长相关蛋白GAP-43表达的影响
目的 观察重组入骨形态发生蛋白-2( rhBMP-2)对体外培养的乳鼠雪旺细胞增殖及生长相关蛋白( GAP-43)表达的影响。方法 将纯化的雪旺细胞分两组,一组设为对照,另一种加含终质量浓度为5 μg/L rhBMP-2的DMEM/F12培养液培养,在培养后0、12、24、36、48、72 h分别用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同时间点的A值并绘制生长曲线;用BrdU法测定雪旺细胞增殖率;用Western blot法检测GAP-43蛋白的表达水平。结果 经含5μg/L rhBMP-2培养液培养的雪旺细胞,在24、36、48 h细胞增殖率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);实验组中GAP-43在24、36、48 h的表达也显著高于对照组(P<0.05)。结论 rhBMP-2有促进雪旺细胞分裂增殖和GAP-43蛋白表达的作用,可能是其促进周围神经再生的重要机制之一。
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脱氧胆酸对胰腺腺泡细胞的损伤及核转录因子活性的影响
目的 观察脱氧胆酸(DCA)对AR42J胰腺腺泡细胞的损伤作用并探讨其对核转录因子(TF)活性的影响。方法 应用噻唑蓝(MTT)比色法检测DCA作用下细胞存活率改变,流式细胞术AV/PI双染法检测细胞的凋亡/坏死率。细胞经0.4mmoL/L DCA分别作用15 min、30 min、4h后收集培液上清,收集细胞并提取细胞质和细胞核蛋白,分别检测培液上清和胞质淀粉酶的活性,利用Luminex检测细胞核TF的DNA结合活性。结果 DCA对AR42J胰腺腺泡细胞的损伤作用呈浓度和时间依赖性,对细胞质内和培液中的淀粉酶水平无明显影响。在检测的40种TF活性变化中,DCA诱导ATF2、AR33、STAT5、NFAT、FKHR和NKX-2.5这6种TF活性明显升高,而RUNX/AML、NF-Y、MEF2和E2F1这4种TF活性则明显下降,其余30种TF活性无明显变化。结论 DCA对腺泡细胞的损伤作用主要表现为凋亡和坏死,对细胞内酶的合成和分泌功能没有明显影响。DCA诱导细胞核TF活性的变化,可能是其诱导细胞损伤的分子生物学基础。
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猪小面积肺栓塞时血流动力学的变化
目的 模拟猪小面积肺栓塞,并对栓塞后的血流、血压及血气变化进行分析。方法 18头健康瑞典家猪建立左下肺动脉栓塞模型。左侧开胸分离出左下肺动脉、左下肺静脉、肺动脉。结扎左下肺动脉,0.5h后解除结扎。检测5h内平均动脉压(MAP)、中心静脉压(CVP)、肺动脉压(PAP)、肺动脉血流量(PAF)、左下肺静脉血流量(LIPVF)以及血气结果的变化。结果 小面积肺栓塞30 min后肺动脉压升高(27.33±1.50) mm Hg(1 mm Hg =0.133 kPa,P<0.05),肺动脉血流降低(4.48±0.53) L/min (P <0.05),主动脉压波动不大(84.76 ±2.89) mm Hg(P>0.05),CO2蓄积(8.58±2.37) kPa(P<0.05),氧分压下降(19.78 ±5.64) kPa(P<0.05),乳酸堆积(1.13±0.31)mmol/L(P <0.05);解除栓塞后各指标均渐恢复至基础状态(P<0.05)。结论 小面积肺栓塞如果及时解除,对实验对象的生命并无威胁。
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骨髓间质干细胞通过影响PI3K/Akt信号通路抑制肝星状细胞的增殖
目的 探讨在体外非接触共培养条件下,大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)如何调控肝星状细胞(HSCs)的增殖。方法 实验组将MSCs/HSCs按2×104/2×104(细胞/孔)的比例接种于Transwell共培养板上下层,建立非接触共培养体系;对照组为HSCs(2 ×104细胞/孔)单独培养;阳性对照组为加入抑制剂LY294002 (20 μmol/ml)观察抑制效果。共培养24、48、72h后应用流式细胞仪分析细胞周期,Western blot检测HSCs的p-Akt及Akt蛋白的表达。结果 共培养24、48、72 h后HSCs的S期细胞与对照组比较明显减少,且抑制程度呈时间依赖性(11.24±0.34 <15.73±0.76<19.14±0.91 <23.16±1.80,P<0.05);加入LY294002后可明显增加共培养组抑制效果,与单独使用抑制剂比较S期细胞减少更加明显(8.2±0.8<11.7±1.6,P<0.05);共培养组及共培养+抑制剂组p-Akt蛋白表达较单独培养组均显著下调,而Akt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);共培养+抑制剂组较共培养组p-Akt蛋白表达下调。结论 MSCs可明显抑制HSCs的增殖,可能是通过影响PI3K/Akt信号通路达到这一作用,磷酸化的Akt蛋白在其中起关键作用。
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环氧化酶-2及B细胞淋巴瘤因子-2在腺性膀胱炎中的表达及其临床意义
目的 检测腺性膀胱炎(CG)组织中环氧化酶-2(COX-2)及B细胞淋巴瘤因子-2(bcl-2)的表达。方法 应用免疫组织化学法观察60例CG、11例慢性膀胱炎(CC)、60例膀胱移行细胞癌(TCC)以及9例正常膀胱移行上皮中COX-2及bcl乏的表达。比较CG患者接受治疗前后膀胱组织中COX-2、bcl-2表达水平的变化。结果 肠化生型CG(CGTT)患者膀胱组织中COX-2及bcl-2的表达水平均显著高于典型型CG(CGTP)、CC患者及正常对照组(P均<0.01)。CGIT与TCC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。CG及TCC患者膀胱组织中COX-2及bcl-2的表达水平均呈显著正相关(P均<0.01)。治疗后CGTP、CGIT患者膀胱组织中COX-2及bcl-2表达水平与治疗前比较均有明显下降(P均<0.01)。结论 CG尤其是CGIT存在恶变潜能。但手术以及术后的化疗药物膀胱灌注治疗可以使这种风险降低。
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骨髓间充质干细胞对大鼠慢性胰腺炎炎性因子的影响
目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)对大鼠慢性胰腺炎(CP)炎性因子的影响。方法 将80只SD大鼠随机分为空白组(20只,注射无菌生理盐水),模型组[20只,尾静脉注射二丁基二氯化物(DBTC)制作大鼠CP模型],假治疗组(20只,尾静脉注射DBTC制作大鼠CP模型后,输入和BMSCs等量的无菌生理盐水)和治疗组(20只,于CP模型制作成功后尾静脉注射体外培养的同种异体BMSCs)。80 d后采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组大鼠胰腺中白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-d、转化生长因子(TGF)-β水平。结果 治疗组中IL-1 (652.326±36.424) ng/L,IL-6(8.347±1.094) ng/L,IL-8( 352.487±69.340) ng/L,rGF-β(0.020±0.006) μg/L,均低于假治疗组与模型组(P<0.05),IL-10(603.799±89.374) ng/L,TNF-α( 507.450±90.130)μg/L则高于假治疗组和模型组(P<0.05)。模型组和假治疗组之间IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 同种异体BMSCs的输入可以降低CP中促炎因子的水平,提高抗炎因子的浓度,有助于减轻CP的炎症反应,减缓甚至阻止CP的发展。
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营养剥夺诱导髓核细胞凋亡与BNIP3蛋白表达上调
目的 通过营养剥夺(低氧-无糖-无血清)诱导髓核细胞凋亡,检测髓核细胞线粒体蛋白BNIP3(bcl-2/Adenovirus El B19-kd Protein-Interacting Protein 3)表达。方法 体外分离培养大鼠尾椎间盘髓核细胞,传代至P1代后将细胞分为正常对照组:DMEM/L培养基(1000 mg葡萄糖/L)、10%胎牛血清、21% O2;实验组:DMEM无糖培养基、无血清、1% O2;分别将两组细胞培养0、24、48、72 h后,免疫荧光检测BNIP3蛋白表达并定位、流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位。结果 免疫荧光检测显示正常对照组细胞低表达BNIP3,定位于胞质且未结合线粒体,实验组显示随培养时间延长,BNIP3表达呈上升趋势,在72 h明显增加,共定位发现BNIP3主要分布于胞质,并与线粒体相结合;流式细胞仪检测发现正常对照组细胞凋亡率为(1.02±0.21)%,实验组细胞凋亡率明显增加(P<0.05),分别为(4.22±0.34)%、(7.5l±2.33)%、( 19.93±2.58)%,线粒体膜电位结果显示实验组24、48、72 h线粒体膜电位均不同程度降低,分别为(90.23±1.32)%、(87.30±2.21)%、(82.63±2.91)%,均显著低于正常对照组(94.21±3.96)%(P<0.05)。结论 营养剥夺可能通过诱导BNIP3表达增加并结合线粒体导致髓核细胞凋亡。
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突变型低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及常氧表达
目的 为了在常氧条件下观察低氧诱导因子-1α( HIF-1 α)在骨缺损部位促新血管生成作用,构建能够同时表达突变型HIF-1α和人源化绿色荧光蛋白(hrGFP)的腺病毒载体并检测其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法 利用聚合酶链式反应(PCR)定点突变人HIF-1α编码区(CDS)第402、564和803位氨基酸,将突变后HIF-1α和hrGFP重组入pAdEasy-1系统,包装病毒并测定滴度。以感染复数(MOI)=100将腺病毒转染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测转染细胞中HIF-1αmRNA和蛋白表达。结果 (1)第402、564和803位氨基酸均定点突变为丙氨酸。(2)A、B两组HIF-1α mRNA表达量明显高于C、D两组,差异有统计学意义(P<0.01);A组HIF-1α蛋白表达量明显高于其他3组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 (1)腺病毒载体Ad-HIF-1 αmu-IRES-hrGFP-1构建成功。(2)突变后HIF-1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。
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血红素氧合酶-1基因转染对移植小肠的保护作用
目的 观察重组腺相关病毒血红素氧合酶-1( HO-1)基因转染对移植小肠的保护作用。方法 建立大鼠同种异位小肠移植模型,实验分为2组:实验组(n=34):供体术前腹腔注射载有HO-1基因的腺相关病毒1.0×1012个/ml,对照组(n=34):供体术前腹腔注射腺相关病毒1.0×1012个/ml,在实验组和对照组中检测小肠移植术后小肠组织中HO-1的活性、HO-1 mRNA含量及细胞凋亡,免疫组织化学检测HO-1蛋白的表达,观察小肠组织病理学变化和受体生存时间。结果 实验组平均生存时间为(6.80±1.56)d,对照组平均生存时间为(5.80±1.28)d,两者之间差异无统计学意义(P>0.05),小肠移植术后24、48 h和5d移植小肠实验组HO-1活性分别为2.11±0.04、1.90±0.04和1.56±0.05,均强于对照组(1.71±0.07、1.56±0.06和1.38±0.08,P<0.05);各组移植肠缺血再灌注损伤程度以术后24h重,实验组缺血再灌注损伤程度轻于对照组;术后24h和48 h实验组HO-1 mRNA表达水平分别为1.12±0.08和0.76 ±0.10,均高于对照组(0.69±0.05和0.38±0.08,P<0.05),术后5 d HO-1 mRNA表达水平两组比较差异无统计学意义(P>0.05);术后各时段移植小肠细胞凋亡数实验组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),生存时间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HO-1基因转染可降低移植小肠缺血再灌注损伤程度。
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潘氏细胞在大鼠休克复苏后肠黏膜重建过程中的作用
目的 观察小肠潘氏细胞在大鼠失血性休克复苏后肠黏膜重建过程中的作用。方法 42只雄性Wistar大鼠建立失血性休克复苏模型,随机分为实验组(n=7)和对照组(n=35),实验组再分5组,分别于复苏后1、3、6、12、24h观察回肠黏膜的形态学改变、复苏前后潘氏细胞数量及形态变化特点及各时相电镜下潘氏细胞结构特点。结果 休克复苏后小肠黏膜明显损伤,集中表现于绒毛部分。复苏后3h为明显,6h后绒毛已开始修复,至24h肠黏膜表面细胞连续性已恢复。复苏后1h,回肠黏膜潘氏细胞计数明显减少(P<0.05),3h降至低(P<0.05),6h后与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。电镜下潘氏细胞表现肠内分泌细胞超微结构特征,核无凋亡改变。结论 失血性休克复苏后肠黏膜屏障早期受损,但具快速重建能力,潘氏细胞颗粒的合成和分泌可受缺血再灌注损伤的诱导。潘氏细胞对维持肠道黏膜防御机制具有重要的生理意义。
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糖尿病大鼠前列腺的形态及基因改变
目的 观察糖尿病对大鼠前列腺形态及基因表达的改变。方法 链脲霉素(STZ,60 mg/kg)诱导糖尿病动物模型,观察前列腺组织形态、筛选表达差异基因及测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学染色法验证Mrel1和Xrcc3表达差异,并检测高糖(25~75 mmol/L)刺激下细胞内活性氧(ROS)强度。结果 糖尿病大鼠前列腺形态上出现显著变化。基因芯片发现糖尿病大鼠的前列腺组织中有2304个差异基因,糖尿病大鼠和糖尿病患者前列腺组织中Mrel1和Xrcc3的表达均下降,而DNA氧化损伤标记物8-OHdG增加,高糖还可导致细胞内氧化应激水平上升。结论 糖尿病可引起前列腺形态异常以及多基因的改变。
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人脑源性神经营养因子重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间质干细胞的研究
目的 探讨增强型绿色荧光蛋白( EGFP)为报告基因、人脑源性神经营养因子(hBDNF)为目的基因的重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP体外转染大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)的特点,从基因转录及蛋白表达水平检测hBDNF基因在体外rMSCs中的表达。方法 分离、培养rMSCs,流式细胞仪检测CD34、CD45、CD29、CD90的表达,腺病毒体外转染第3代rMSCs,荧光显微镜下观察绿色荧光信号,流式细胞仪检测转染率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测hBDNF mRNA和hBDNF蛋白的表达。结果 CD34、CD45、CD29、CD90阳性细胞比率分别为0.8%、6.8%、98.9%、99.9%。腺病毒转染rMSCs后可见绿色荧光信号,强度随腺病毒感染复数(MOI)的增加而增强;MOI为10、20、50、100、200时,转染3d后,转染率分别为20.2%、43.2%、67.2%、100.0%、100.0%;hBDNF mRNA及hBDNF蛋白的表达水平亦随腺病毒MOI的增加而增加,当MOI=100时,表达到高峰,3~l0d为表达高峰期。结论 重组腺病毒体外有效转染rMSCs,成功获取基因工程干细胞hBDNF-rMSCs,该细胞可大量表达hBDNF mRNA及hBDNF蛋白,表达水平与MOI及转染时间明显相关。
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N-cadherin、 β-连环素在肝癌组织中的表达及与Wnt信号途径的关系
目的 观察肝癌(HCC)中N-cadherin分子是否调控β-连环素(β-catenin)的表达及Wnt信号途径的活化。方法 免疫组织化学分析64例肝癌组织中N-cadherin及β-catenin的表达及相互关系。调控肝癌细胞株HCCLM3、SMMC-7721中N-cadherin表达并检测β-catenin的表达及Wnt信号途径的活化。结果 64例肝癌中,N-cadherin表达缺失34例;β-catenin在细胞膜上表达,无细胞核内聚集,且13例细胞膜表达缺失;细胞膜上β-catenin表达缺失与N-cadherin表达缺失呈正相关(P<0.05)。下调HCCLM3细胞或上调SMMC-7721细胞中的N-cadherin表达导致细胞膜上β-catenin表达减弱或增强,但均未导致Wnt信号途径的活化。结论 在肝癌中,N-cadherin表达与细胞膜上β-catenin的表达水平呈正相关,但N-cadherin分子并不参与Wnt信号途径的调控。
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大鼠半胱氨酸蛋白水解酶-3基因真核表达质粒和RNA干扰质粒的构建及鉴定
目的 构建SD大鼠半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的真核表达质粒和干扰质粒,探究干扰质粒对Caspase-3表达的干预效应。方法 从SD大鼠软骨终板细胞中获得模板cDNA并扩增,约834 bp。克隆至载体pEGFP-N1,获得重组质粒pEGFP-N1-Caspase-3。针对Caspase-3设计4对RNAi靶点序列,克隆至载体pcDNA6.2。成功构建pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3、pcDNA6.2-Caspase-3-4,构建对照质粒pcDNA6.2-miRNA。将5个干扰质粒分别与pEGFP-N1-Caspase-3(用量比为7:1)共转染至293T细胞,qPCR检测转染48h后对Caspase-3表达的干预效应。结果 通过菌落聚合酶链反应(PCR)、酶切及测序表明pEGFP-N1-Caspase-3和干扰质粒构建成功;共转293T细胞后,qPCR示pcDNA6.2-Caspase-3-2、pcDNA6.2-Caspase-3-3干预组的Caspase-3的表达高于对照组,分别为33%和8%,而pcDNA6.2-Caspase-3-1、pcDNA6.2-Caspase-3-4干预组的Caspase-3的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别为24%和67% (P <0.05)。结论 成功构建了Caspase-3的表达质粒和干扰质粒,并证实pcDNA6.2-Caspase-3-4对Caspase-3的表达具有明显的抑制效应。
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血管内皮生长因子对关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶的影响
目的 观察血管内皮生长因子(VEGF)对体外培养的关节软骨细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响。方法 体外培养SD乳鼠关节软骨细胞,用白细胞介素(IL)-1β诱导的方法建立骨关节炎(OA)体外模型,实验分为4组,每组加入不同处理因素进行干预,A组:(正常对照组)不加任何处理因素;B组:10 μg/L VEGF;C组:10 μg/L IL-1β;D组:10 μg/L VEGF+ 10 μg/LIL-1β。采用实时荧光定量PCR( Real Time PCR)检测iNOS mRNA的表达,采用蛋白免疫印迹法( Western blot)检测iNOS蛋白的表达。结果 iNOS mRNA的表达:A组iNOS mRNA无表达,B组(9.64±1.64)、C组(17.27±2.01)及D组(28.93±6.63),3组的iNOS mRNA表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平明显高于B组(P<0.01)及C组(P<0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P<0.05)。iNOS蛋白的表达:A组iNOS蛋白无表达,B组(0.44±0.12)、C组(0.74±0.07)及D组(1.38±0.38),3组的iNOS蛋白表达量显著升高,进一步组间比较,D组软骨细胞iNOS的蛋白表达水平明显高于B组(P<0.01)及C组(P<0.05),C组软骨细胞iNOS的mRNA表达水平高于B组(P<0.01)。结论 在OA的发病过程中,VEGF可能通过上调软骨细胞iNOS的表达发挥重要作用。
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结直肠癌表观沉默蛋白Bmi1与Notch信号通路调控的关系
目的 探讨人结直肠癌中表观沉默蛋白Bmi1和Notch1的蛋白表达与结直肠癌病理特征的关系,观察Notch通路对结直肠癌细胞增殖凋亡及Bmi1表达的影响。方法 应用免疫组织化学技术(SP法)检测85例结直肠癌组织及其邻近正常肠黏膜中Notch1及Bmi1的蛋白表达;将Notch1通路中γ-分泌酶抑制剂DAPT,作用于结肠癌SW480细胞株,运用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖状态;流式细胞仪观察其对细胞凋亡的影响,Western blot检测ICN及Bmi1蛋白的表达。结果 结直肠癌组织中Notch1和Bmi1蛋白表达的阳性率明显高于正常肠黏膜(P<0.05),分别为61.2% (52/85)对15.3% (13/85)和56.5% (48/85)对17.6% (15/85);Bmi1表达率与Notch1表达率呈正相关(r =0.625,P<0.01),并与肿瘤分化程度、分期及淋巴结转移有关(P<0.05);阻断Notch1通路(DAPT)可抑制SW480细胞的增殖,诱导其凋亡,作用12、24、36 h后其增殖抑制率分别为13.1%、17.5及22.6%,而凋亡率为32.7%、45.6%及67.2%;同时Notch1胞内活性段ICN随作用时间延长而下降,而Bmi1表达水平也逐渐降低。结论 结直肠癌中Bmi1与Notch1表达密切相关,阻断Notch通路可抑制Bmi1表达,同时可抑制结肠癌细胞的增殖,促进其凋亡。
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乳腺癌他莫昔芬耐药与雌激素受体β亚型表达的关系
目的 探讨雌激素受体亚型β(ERβ)及其剪切变异体ERβcx表达与乳腺癌他莫昔芬治疗耐药的关系。方法 将MCF-7细胞、MCF-7/TAM-R细胞(他莫昔芬耐药株)以及5-氮杂胞苷(5-AZA-CdR)去甲基化作用后的MCF-75-AZA细胞和MCF-7/TAM-R5-AZA细胞采用Western blot检测ERα、ERβ和ERβcx蛋白的表达;将MCF-7细胞作为对照,用他莫昔芬干预上述细胞,噻唑蓝(MTT)比色法观察细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 ERα的表达在各组间无明显差异;ERβ的表达差异有统计学意义(P<0.01),在MCF-7/TAM-R组细胞中低,在MCF-75-AZA组中高;MCF-7和MCF-7/TAM-R组的ERβcx表达差异无统计学意义(P>0.05),但明显低于MCF-75-AZA和MCF-7/TAM-R5-AZA组的表达(P<0.01)。MTT检测结果显示,与对照组比较,他莫昔芬干预后MCF-7/TAM-R 细胞增殖速度差异无统计学意义(P>0.05);而MCF-7、MCF-75-AZA和MCF-7/TAM-R5-A细胞生长均受到抑制,其中MCF-75-AZA细胞受抑程度强于MCF-7细胞(P<0.01),而MCF-7/TAM-R5-AZA细胞受抑制的程度低于MCF-7细胞(P<0.01)。流式细胞仪测定这3组细胞的S期比率都明显下降。结论 ERβ蛋白表达和他莫昔芬治疗内分泌治疗敏感相关,ERβcx蛋白表达与耐药无关,但可能与ERβ共同影响乳腺癌对他莫昔芬治疗的敏感性。5-AZA-CdR去甲基化可以诱导乳腺癌细胞ERβ及其剪切异构体ERβcx表达增强,改善他莫西芬治疗效果。
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聚对二氧环己酮血管外支架抑制移植静脉内膜增生的机制
目的 构建可降解性聚对二氧环己酮(PDS)血管外支架抑制移植静脉内膜增生的动物模型,探讨PDS外支架抑制移植静脉内膜增生的作用及其机制。方法 建立兔颈外静脉移植模型,24只新西兰大白兔分为单纯移植组(n=12)和PDS外支架组(n=12)。术后4周及12周取出移植静脉,测量移植静脉内膜、中层面积及厚度,免疫组织化学法和实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和肾素-血管紧张素Ⅱ受体1( AT1 R)表达。结果 24只兔均存活,移植血管全部通畅。外支架组中膜面积、内膜面积、中膜厚度、内膜厚度各值皆小于单纯移植组,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学与RT-PCR检测表明血管外支架组TGF-β1在外膜中过度表达,而中膜和内膜表达减少。术后4周,外支架组AT1R表达水平低于对照组,12周时,两组AT1R表达水平都降低,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 大孔隙、非限制性PDS血管外支架通过形成新生外膜、调节细胞因子再分布等机制有效地抑制内膜和中膜的增生,其用于抑制移植静脉内膜增生是可行的。
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吲哚胺2,3双加氧酶对小鼠CD4+T细胞增殖的抑制作用
目的 探讨吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)抑制T细胞增殖的机制。方法 通过低色氨酸(10μmol/L)培养基(LTM)和/或添加不同浓度(50、100、200和400μmol/L)色氨酸代谢产物(TC),观察小鼠树突细胞(DC)与异系CD4+T细胞培养体系中后者的增殖。Annexin-V及碘化丙锭(PI)双染法测定CD4+T细胞凋亡。结果 LTM中CD4+T细胞增殖指数(2.718 ±0.010)及抑制CD4+T细胞增殖的TC浓度(200μmol/L KYN或50 μmol/L 3-HAA)较正常色氨酸培养基(NTM)(3.385 ±0.013,400 μmol/L KYN或100 μmol/L 3-HAA)显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。LTM中CD4+T细胞早期凋亡率(33.163±0.556)%显著高于NTM(8.867 ±0.565)% (P <0.01)。NTM中CD4+T细胞凋亡率随3-HAA浓度升高而增加[3-HAA浓度50、100、200和400 μmol/L组中分别为(14.433 ±0.640)%、(22.273±0.629)%、(37.363±0.953)%和(46.643±0.633)%]。结论 LTM及TC均可通过诱导凋亡来抑制CD4+T细胞增殖,两者具有叠加效应。
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核仁组成区嗜银蛋白及Ki-67在乳腺癌前驱病变中的意义
目的 探讨核仁组成区嗜银蛋白(AgNOR)及细胞增殖指数(PIKi-67)在乳腺癌前驱病变中的意义。方法 将76例乳腺癌前驱病变,包括导管上皮不典型增生( ADH) 25例、低度导管原位癌(DCIS) 17例、中度导管原位癌14例及高度导管原位癌20例,制成组织芯片,进行AgNOR嗜银染色及Ki-67免疫组织化学染色,图像定量分析AgNOR染色结果并计算PIKi-67。结果 AgNOR颗粒形态、大小在各病变中存在差异;每个细胞AgNOR颗粒平均个数、AgNOR颗粒总面积、单个Ag-NOR颗粒面积、PI Ki-67从ADH到高度DCIS逐渐增高,ADH、低度DCIS与高度DCIS的差异均有统计学意义(P<0.01),ADH与低度DCIS在每个细胞AgNOR颗粒平均个数上的差异有统计学意义(P<0.05)。结论 AgNOR与Ki-67是乳腺癌前驱病变诊断及鉴别诊断的指标之一。
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功能性直肠癌扩大根治术对男性性功能的影响
目的 观察盆腔自主神经的解剖,减少直肠癌扩大根治术中对自主神经的损伤。分析在全直肠系膜切除基础上行保留神经的功能性直肠癌扩大根治性术对男性直肠癌患者性功能的应用价值,并与传统扩大根治术比较。方法 采用对6例盆腔器官作解剖学研究,观察盆腔自主神经的走行及分布结果,并通过调查表的方式调查306例男性中下段直肠癌扩大根治术病例保留神经组和传统扩大根治术组性功能障碍的发生率。结果 分析两组患者术后勃起功能障碍、性兴趣减退、射精功能障碍的发生率分别35.2% (44/125)、62.2% (46/74),76.8%( 19/125)、52.7%( 30/74),15.2%(29/125)、40.5%(35/74),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 保留盆腔自主神经的直肠癌扩大根治术可以改善患者的性功能障碍率。
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粉防己碱对膀胱癌BIU-87/ADM细胞株的耐药逆转作用及其机制
目的 探讨粉防己碱(TET)对膀胱癌耐药株BIU-87/ADM多药耐药性(MDR)的逆转作用及其机制。方法 应用CCK法观察不同浓度TET( 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)对BIU-87和BIU-87/ADM细胞生长的抑制作用,并测定1 mg/L TET逆转多药耐药的活性;Annexin-V与PI双染法流式细胞术分析1 mg/L TET对细胞凋亡的影响;免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测1 mg/L TET对P-gp蛋白和MDR1表达水平的影响;细胞免疫化学法和RT-PCR法检测1 mg/L TET对BIU-87/ADM细胞Caspase-3和Survivin表达水平的影响。结果 1.0 mg/L无毒剂量下的TET显著增加阿霉素(ADM)对耐药株BIU-87/ADM的细胞毒性作用(P<0.01),逆转指数(RF)为5.33,而对敏感株BIU-87无明显作用(P>0.05),RF为1.33;1.0 mg/L TET和1.5 mg/LADM共同作用48 h,能使BIU-87/ADM细胞凋亡率增加至(40.86±4.35)%,与单独应用ADM的(12.42 ±3.24)%比较差异有统计学意义(P<0.01)。而BIU-87细胞凋亡率为(61.23 ±5.46)%,与单独应用ADM的(57.79±4.73)%比较差异无统计学意义(P>0.05)。TET能明显抑制mdr1mRNA和P-gp蛋白在BIU-87/ADM的表达;与单用ADM比较,TET和ADM联用能使BIU-87/ADM细胞株中Caspase-3的表达水平明显升高(P<0.01),Survivin的表达水平显著降低(P<0.01)。结论 粉防己碱能逆转BIU-87/ADM细胞的多药耐药性,这一作用可能与粉防己碱抑制P-gp的表达和增强化疗药诱导细胞凋亡有关。
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STAT3及其磷酸化在食管鳞癌组织中的表达及其意义
目的 检测食管鳞癌组织中信号转导子和转录激活子3( STAT3)在mRNA、蛋白质和蛋白质磷酸化3种水平的表达,探讨其在食管鳞癌发生、发展、浸润、转移中的作用。方法 检测43例食管鳞癌组织中的STAT3 mRNA、STAT3和磷酸化STAT3( pSTAT3)的表达,并与相应癌旁正常食管组织作对照研究,分析STAT3 mRNA、STAT3和pSTAT3的表达与临床病理参数的关系。结果 43例实验样本中(1)食管鳞癌组织中STAT3 mRNA相对表达强度比值(1.43±0.59)较癌旁组织的比值(0.98±0.47)明显增高(P<0.05);(2)食管鳞癌组织中STAT3、pSTAT3表达(2.16±0.39、1.40±0.15)也都显著高于癌旁组织(1.87±0.29、1.25±0.13,P<0.05);(3)食管鳞癌组织中STAT3mRNA、STAT3和pSTAT3在肿瘤不同分化级别中表达差异有统计学意义,分化级别越低,表达水平越高(P<0.05),并与肿瘤分化级别呈负相关(-1 <r<-0.301,P<0.05);它们在TNM分期中Ⅲ期组的表达均高于Ⅰ~Ⅱ期组(P<0.05),伴有淋巴结转移组表达也都高于无淋巴结转移组(P<0.05),并与两者呈正相关(两者均为0.301 <r<1,P<0.05);但未发现它们在性别、年龄、家族史、吸烟史中差异有统计学意义(P>0.05)。结论 食管鳞癌组织中STAT3磷酸化异常激活后,导致STAT3mRNA、STAT3和pSTAT3的高表达,与食管鳞癌的分化、浸润、转移相关。
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过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂罗格列酮对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响
目的 观察过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ2的激动剂罗格列酮对大鼠成骨细胞增殖和分化能力的影响。方法 取新生SD大鼠颅骨进行原代培养,经碱性磷酸酶ALP染色和矿化结节检测鉴定为成骨细胞。实验分为6组:取第3代细胞接种至96孔板,根据加入罗格列酮的浓度的不同分为A、B、C、D、E、F组(浓度分别为0、1、2、5、10、20 μmol/L),A组为对照组,B~F组为实验组。每组5个复孔,经罗格列酮作用24h后,应用噻唑蓝(MTT)比色法和PNPP法检测大鼠成骨细胞增殖和ALP活性的变化。结果 作用24h后,6种浓度罗格列酮对大鼠成骨细胞增殖作用均无影响,且组间差异无统计学意义(F=1.335,P>0.05);但各实验组大鼠成骨细胞ALP活性均较对照组降低,并具浓度依赖性,组间差异有统计学意义(F=82.304,P<0.01)。结论 一定剂量的罗格列酮对大鼠成骨细胞无明显促增殖作用,但却明显抑制了大鼠成骨细胞的分化,表明罗格列酮可影响成骨活性,提示PPARγ2参与了机体的成骨过程,在骨质疏松的发病中发挥一定了的作用。
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腹膜后神经鞘瘤一例诊治分析
腹膜后神经鞘瘤是一种少见的腹膜后肿瘤[1-2],其部位深在,术前诊断困难。我院于2010年收治l例腹膜后巨大神经鞘瘤,现报道如下。一、资料与方法1.一般资料:患者女性,55岁,发现左中腹可触及一拳头大小包块而就诊。既往史、家族史无特殊。查体左中腹可及10 cm×7 cm大小包块,质中等,边界清楚,活动度差,无压痛。腹部B超示左肾上方10 cm×8 cm实质包块。腹部CT平扫示左肾上腺区可见14 cm×6 cm大小实性肿瘤,包膜完整,边缘光滑,形如哑铃状,其内密度不均,见散在钙化灶。增强扫描肿瘤周边呈不规则强化,瘤体与左肾动脉粘连,与腹主动脉紧邻,部分与椎体相连,紧贴腰大肌。
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miR-106a在星形细胞瘤中的表达及其临床意义
我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术定量检测80例星形细胞瘤组织中miR-106a的表达水平,分析其表达水平与临床病理特征以及患者预后的关系,观察miR-106a在星形细胞瘤发生过程的作用[1]。一、材料与方法1.一般资料:2000年到2008年间在常州市第一人民医院神经外科接受诊断与治疗的80例星形细胞瘤患者,其中20例有癌旁组织,均保存于液氮中。临床随访数据建立在定期随访基础上,第1年每3个月1次,第2年半年1次,其后每年1次直到患者死亡。随访期从手术日期起算到死亡日期或到后一次随访日期止。
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地塞米松加低分子右旋糖酐预防大鼠脂肪栓塞综合征
脂肪栓塞综合征(FES)是创伤骨折的常见并发症之一[1-2]。临床研究结果显示,低分子右旋糖酐与地塞米松联用预防FES作用强于单独使用低分子右旋糖酐、地塞米松[3],但尚无实验证实。我们以油酸静脉注射法建立FES动物模型[4],观察两药联用对FES的预防作用并探讨其机制。一、材料与方法1.实验方法:雄性Wistar健康大鼠(广州军区武汉总医院实验中心提供),体质量300~320 g,随机分为4组,每组20只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,经尾静脉注射油酸(国药集团,0.2 ml/kg)加相应药物:低分子右旋糖酐(武汉滨湖双鹤药业)20 ml/kg组(A组),地塞米松(湖北天药药业)35 mg/kg组(B组),地塞米松25 mg/kg及低分子右旋糖酐20 ml/kg联用组(C组),空白组(D组)。
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用于心肌保护的中华小型猪体外循环模型
猪的心血管系统解剖结构、生理功能,尤其是冠状动脉系统接近人类,是研究心肌保护的理想实验模型[1]。我们2007年1月至2008年3月,完成小型猪体外循环下心内直视手术20例,探讨小型猪体外循环模型的麻醉管理、心脏解剖特点及体外循环特点。一、材料和方法1.实验动物:中华小型猪20头,体质量(25.2±2.3)kg。术前禁食12 h,禁饮8h。
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表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌HCT-8和HT29细胞株的作用及对Notch1与Notch2的基因表达的影响
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶多酚中含量高、活性强的单体,具有抗癌作用[1]。本研究旨在观察EGCG对结肠癌细胞HCT-8和HT29细胞增殖的抑制作用及对Notch1与Notch2基因的影响,探讨其抑癌机制。一、材料与方法1.噻唑蓝(MTT)比色法检测EGCG对细胞增殖的抑制作用:将细胞接种于96孔板中,将孔中添加终质量浓度为0 mg/L(对照组),10、20、35 mg/L EGCG(实验组)的完全培养基,孵育24、72 h,加入CCK-8反应液,酶标仪读数后,计算抑制率。
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原发及继发性高血压患者血浆肾上腺髓质素水平的变化
肾上腺髓质素(ADM)是日本学者1993年发现的一种新的血管活性多肽,主要分部在肾上腺髓质,有较强的降压作用,为非胆碱能、非肾上腺素能系统的血管活性物质[1-2]。本文旨在观察原发性高血压(EH)及几种继发性高血压(SH)疾病患者血浆ADM水平的变化,包括肾上腺髓质增生(AMH)和嗜铬细胞瘤(PC),并探讨其在这几种疾病病理生理过程中所起的作用和鉴别诊断中的意义。
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亚洲型股骨近端防旋髓内钉治疗高龄股骨粗隆间骨折
使用闭合复位髓内固定技术治疗股骨粗隆间骨折具有创伤小,手术时间短,内固定稳定性高等优点[1-2]。亚洲型股骨近端防旋髓内钉(PFNA-Ⅱ)是在股骨近端防旋髓内钉( PFNA)基础上,针对亚洲人群改良的防旋髓内钉。我院自2010年3月至2010年9月,使用PFNA-Ⅱ治疗42例高龄股骨粗隆间骨折患者,疗效较好。 一、资料与方法 1.一般资料:本组42例,其中男11例,女31例;年龄69 ~ 91岁,平均75.3岁。左侧24例,右侧18例。按AO分类标准:31-A1型14例,31-A2型21例,31-A3型7例。均为闭合性骨折。其中合并高血压、心脏病、糖尿病等内科疾患者39例,合并同侧桡骨远端骨折2例,同侧肱骨近端骨折1例,均排除病理性骨折。其致伤原因:平地摔伤39例;交通伤3例。内固定材料为瑞士Synthes公司的PFNA-Ⅱ。
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目测法判断脑脊液黄变对筛查蛛网膜下腔出血的作用
迅速和准确的诊断对蛛网膜下腔出血(SAH)救治非常重要[1-2]。目前临床通常采取CT扫描对SAH进行初筛。CT对SAH的敏感性很高,但仍不能检出所有的SAH[3]。对于正常或模棱两可的CT扫描结果,需要腰椎穿刺(简称腰穿,LP)以辅助诊断。在脑脊液(CSF)检查中,大量未清除的红细胞可以支持SAH的诊断,但由于红细胞有可能来自腰穿过程,因此红细胞不能作为诊断依据[4]。我们通过分析13年内在吉林省延边第二人民医院急诊科初诊为SAH患者的资料,评价目测法判断CSF黄变对SAH诊断的敏感性。
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铁调素在正常和高铁环境下对成骨细胞内钙离子的影响
近年研究结果表明,铁过载是区别于传统因素之外的另一骨质疏松的重要危险因素,去铁铵等降低体内铁过载的药物已在动物实验被证实可以改善骨质疏松,并在细胞层面改善骨代谢指标[1]。在降铁措施中,除去铁铵和去铁酮等药物之外,近年发现的铁调素作为一种内源性降铁多肽,通过抑制肠道对铁的吸收而降低铁过载,具有良好的治疗骨质疏松的前景[2]。本研究旨在观察铁调素对成骨细胞内钙离子的影响,探讨正常和高铁环境下铁调素对成骨细胞的作用是否有所不同。
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大鼠胰腺癌组织蛋白组学分析
我们诱导形成与人类胰腺癌的病理生物学特性很相近的大鼠胰腺癌[1],并将大鼠胰腺癌组织作为研究对象,进行双向电泳和质谱分析,初步筛选胰腺癌组织与正常胰腺组织中的差异蛋白质。一、材料与方法清洁级SD大鼠70只,随机分为模型组50只和假手术组20只。模型组将二甲基苯并蒽(DMBA)植入胰腺被膜内并荷包缝合后关腹。假手术对照组只进行荷包缝合。术后两个月处死。所有胰腺组织取下后,各取1块组织行苏木素-伊红(HE)染色,进一步确认癌组织及良性组织。分别取胰腺癌模型及正常胰腺组织,参照文献[2]方法制备组织总蛋白。等电聚焦主要按IPGphor电聚焦系统指南以及Rajcevic等[3]的方法优化进行。为了减小误差,每份蛋白样品重复电泳3次。凝胶染色参照文献[4]优化进行。
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4-硝基喹啉-1-氧化物饮水法构建BALB/C小鼠胃癌及食管癌模型
4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)饮水法已用于建立小鼠口腔癌模型[1]。我们采用4NQO饮水法构建小鼠舌癌模型,在实验中可见部分小鼠产生食管癌或胃癌,舌部病变仅为中度异常增生。一、材料与方法清洁级6周龄雄性Balb/c小鼠,体质量(23.52±1.15)g,标准喂养,随机分为实验组和对照组。实验组4NQO(美国Sigma公司)配成200 mg/L浓度置于避光瓶中喂养17 ~20周,观察至28周,对照组自来水喂养。8 ~28周时,每2周处死实验组4只及对照组2只小鼠,取舌、食管、胃、肺、肝、肾等,苏木素-伊红(HE)染色观察组织学改变。
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带蒂筋膜瓣促血管化成骨与膜诱导成骨作用的比较
本研究旨在比较带蒂筋膜瓣促血管化成骨与膜诱导成骨作用,现报道如下。一、材料与方法1.组织工程骨制备:成年新西兰大白兔75只,雌雄不限,年龄4~5个月,体质量2.0~2.5 kg,每只兔分点抽取自体红骨髓共8ml,应用淋巴分离液经密度梯度离心去除红细胞等纯化处理后,取中间分离出的单个核细胞层,通过稀释获得浓度为1×108/ml的含有骨髓基质干细胞(BMSC)的单核细胞悬液2ml,将含有骨形态发生蛋白(BMP)的生物支架材料即骨诱导活性材料(OAM)切成符合动物造模后骨缺损大小的条块状,置于含庆大霉素16万U抗生素生理盐水中复水5 min取出,放入含BMSC的上述试管中充分浸泡混合10 min,制成自体BMSC+ OAM的组织工程化骨,使用前配置。
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无创式大鼠气管插管术
受限于解剖因素,气管切开是大鼠气管插管的主要方式[1-2]。近年来,我们尝试明视下经口插管,收到了一定效果,报道如下。一、材料与方法8~10周龄大鼠130只,体质量300~350 g。戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后仰卧位固定,上切牙套线供牵引。将局部光源照射于大鼠颈部,操作者左手以一定张力将鼠舌外拉,右手以直角钳将舌根部上抬后钳柄交左手与鼠舌一起固定。右手环指与小指夹持套线向下施力,使鼠头尽量后仰致胸部、颈部与下颌成一条直线,此时可于口腔内视野的前上方看到随呼吸而启闭的鱼口状声门。
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慢性溃疡创面病原菌检测及耐药性分析
感染一直是造成溃疡创面长期不易愈合的主要原因之一。为探讨慢性溃疡创口的病原菌分布和对抗菌素的耐药状况,现对我院2009年1月至2010年12月两年间,外科伤口门诊治疗的426例慢性溃疡创口患者创口(面)分泌物标本病原菌和药敏结果进行分析。一、材料和方法1.一般资料:2009年1月至2010年12月,我院外科伤口门诊治疗的慢性不愈伤口患者共426例,取创面分泌物进行细菌培养。慢性不愈伤口标准:伤口愈合时间大于4周,伤口周围有红肿或伤口基底部肉芽水肿或有出血点。
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吗啡预处理对脑缺血再灌注损伤后神经元凋亡及bcl-2的影响
凋亡是脑缺血后神经元丢失的重要途径,抑制神经元凋亡是目前治疗脑缺血损伤的研究热点[1]。本研究旨在观察吗啡对海马神经元凋亡的影响,探讨吗啡是否具有脑保护作用及可能的作用机制。一、材料与方法1.动物及分组:健康成年雄性Wistar大鼠72只,随机分为假手术组、模型组、吗啡低剂量和高剂量组,各18只。2.造模方法及干预措施:模型组、吗啡组大鼠参考Pusinelli法建立脑缺血模型:俯卧位下用烧灼器烧闭椎动脉,再仰卧位下分离两侧颈总动脉。监测脑电图,用无创血管夹同时夹闭双侧颈总动脉,若30 ~60 s内出现意识丧失、眼球变白、瞳孔散大及脑电图呈直线的大鼠,为造模成功,8 min后撤去血管夹,为再灌注起始点。假手术组大鼠仅暴露双侧翼孔及颈总动脉而不阻断;吗啡低剂量和高剂量组在缺血前60 min腹腔内分别注射吗啡1 mg/kg及吗啡7 mg/kg,模型组大鼠腹腔内注射等量生理盐水。
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人胚胎干细胞培养的相关因素分析
人胚胎干细胞(HESC)是一种存在于着床前胚胎,能在体外进行培养传代,保持未分化二倍体状态,具有分化发育成3个胚层组织细胞潜能的全能性细胞[1]。目前已有多个实验室对HESC进行广泛的研究,由于HESC的原代培养尤其重要,本实验旨在探讨其原代培养相关影响因素。一、材料和方法1.材料:DMEM培养基、HESC专用胎牛血清、L-谷氨酰胺及胰蛋白酶、丝裂霉素、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等均购自武汉大风公司。
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可吸收缝线张力带环扎绑扎髌骨骨折的临床研究
我院2005年以来采用可吸收缝线张力带环扎绑扎法治疗髌骨骨折57例,现报道如下。一、对象与方法1.一般资料:2005年8月至2011年3月收治闭合性有手术指征(根据X线表现)的髌骨骨折共114例,随机分成可吸收缝线张力带及环扎绑扎法治疗组患者57例(观察组Ⅰ),克氏针钢丝张力带固定治疗组患者57例(对照组Ⅱ),两组病例均得到随访,随访时间6~18个月。组Ⅰ 57例,男39例,女18例,年龄(45.46±13.69)岁,骨折类型:横行骨折30例,粉碎骨折49例,其中骨折块3块以上18例。对照组57例,男40例,女17例,年龄(52.25±15.28)岁,骨折类型:横行骨折25例,粉碎骨折32例,其中骨折块3块以上15例。两组患者性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
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大鼠颅脑损伤伴休克所致小肠过氧化损伤及ω-3多不饱和脂肪酸的保护作用
颅脑损伤伴失血性休克(TBIS)是临床上常见的危重症之一,常伴有多器官功能障碍综合症( MODS),而肠道是TBIS时早受累的器官之一,也是MODS的“始动器官”[1]。近年来,肠内及肠外免疫营养对危重病预后的影响越来越受到重视[2-3]。我们应用ω-3多不饱和脂肪酸( PUFA)对颅脑损伤伴失血性休克( TBIS)大鼠进行术前干预,观察ω-3 PUFA对TBIS大鼠小肠过氧化损伤及细菌移位的影响,探讨其对肠黏膜的保护作用及可能机制。一、材料与方法1.实验动物分组:成年雄性Wistar大鼠36只。随机分成假手术组(C组)、TBIS模型组及ω-3 PUFA治疗组,每组12只。
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兔肝癌动脉插管介入技术研究
兔VX2肝癌模型是一种适合经导管动脉化疗栓塞术( TACE)实验研究的肝癌动物模型。我们对兔VX2肝癌模型介入插管技术进行了改良,提高了插管成功率,现报道如下。一、材料与方法1.材料:6 ~8个月龄新西兰大白兔20只,体质量2.0~2.5 kg,雌雄不限,购自山东省农业科学院。VX2瘤细胞株由美国引进。介入器械:3F微导管及微导丝、自制股动脉导管鞘等。主要设备:德国西门子大C臂数字减影血管造影(DSA)。2.建立移植性肝癌模型:将瘤细胞接种于兔大腿内侧近腹股沟部位皮下,使其成瘤并传代,2周左右瘤体可长至1 ~2 em3,手术取出传代瘤株,取靠近边缘的鱼肉样肿瘤组织在平皿上剪成l~2 mm3的小块,以生理盐水反复冲洗,作为瘤种备用。将预接种兔麻醉后固定,剑突下切口长1 ~2 em打开腹腔,暴露肝脏。
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腔镜与传统甲状腺手术对机体创伤的比较
目的 探讨胸乳路径腔镜甲状腺手术对机体的创伤性。方法 将2009年1月至2010年12月收治的60例甲状腺良性肿瘤依据患者意愿分成腔镜手术组(A组=32例)及传统手术组(B组=28例),分别比较术后2h、1d和3d3个时点外周血白细胞介素-2( IL)-2、IL-6、C-反应蛋白(CRP)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测值。结果 腔镜组术后3个对应时点血清IL-2值[(12.6±2.1)、(11.8±1.9)、(11.8±3.0) ng/L]、CRP值[(1.6±0.7)、(2.4±0.9)、(2.5±0.9) mg/L]、TNF-α值[(53.2±6.8)、(49.1±5.5)、(46.5±5.0) ng/L]与传统组术后相对应3个时点血清IL-2值[(10.6±1.1)、(11.2±2.6)、(12.0±3.2) ng/L]、CRP值[(0.8±0.6)、(2.4±0.5)、(2.4±0.7) mg/L]、TNF-α值[(48.5±7.1)、(51.3±6.2)、(41.5±13.7)ng/L]组间差异无统计学意义(P值均>0.05);腔镜组术后3个对应时点血清IL-6值[(4.8±2.4)、(4.3±2.1)、(5.4±5.6)ng/L]与传统手术组术后相对应时段血清IL-6值[(6.4±2.4)、(7.1±4.1)、(4.9±0.8)ng/L]组间术后2h、1d差异有统计学意义(P<0.05)。结论 腔镜甲状腺手术对机体的创伤与传统甲状腺手术比较属相对微创,在不给机体带来更大创伤同时,可获得美容效果,是一种值得推广的术式。
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食管胃结合部腺癌的淋巴结转移规律
目的 分析食管胃结合部腺癌(AEG)的淋巴结转移规律,为其手术范围提供参考依据。方法 选择我院1989年1月至2010年12月行根治性切除手术的食管胃结合部腺癌119例,记录每例患者的淋巴结数目和大小,计算淋巴结总数和平均值,计算总体淋巴结转移率以及分组淋巴结转移率。结果 119例手术标本共检出淋巴结6537枚(30 ~ 157枚),平均(54.93±19.20)枚/例。119例中89例有淋巴结转移,总体淋巴结转移率74.79%,Siewert Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型患者的淋巴结转移率分别为47.62%、71.11%和88.68%(x2=13.968,P<0.01)。Siewert Ⅰ型患者有No.1 ~4、No.19 ~ 20和No.110~112淋巴结转移,No.5 ~6和No.10 ~ 11淋巴结无转移;不同的是,SiewertⅡ型和Ⅲ型患者有No.5 ~6和No.10~11淋巴结转移,而No.111 ~ 112淋巴结无转移。结论 食管胃结合部腺癌的淋巴结转移有明显规律,有助于指导手术范围。
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腹部二次手术经原切口两种手术入路对照研究
目的 比较腹部二次手术行改良腹直肌后鞘入路较直接经腹直肌后鞘入路的效果。方法 2008年11月至2010年11月河南省肿瘤医院普外科68例胃肠道肿瘤术后二次手术探查患者随机分为改良腹直肌后鞘入路和直接经腹直肌后鞘人路二组,对照研究两组进腹出血量,进腹手术时间,肠管损伤例数,术后排气时间,切口疝和粘连性肠梗阻发生率等指标。结果 改良腹直肌后鞘入路组在进腹出血量、进腹手术时间和肠管损伤例数方面均少于直接经腹直肌后鞘入路组,两组差异有统计学意义(P>0.05),而术后排气时间两组差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者术后均未有切口疝及粘连性肠梗阻发生。结论 改良腹直肌后鞘入路较直接腹直肌后鞘人路分离腹腔粘连更具操作简单、出血少、损伤小等优点。
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细胞分选技术应用的研究进展
随着细胞治疗和基因治疗技术的不断发展,细胞的相关研究已经逐渐成为当前医学乃至整个生命科学领域中的研究热点,细胞培养已经成为科研中一个很重要的技术,而要获得较纯的目的细胞,细胞分选、纯化已成为关键的问题[1-2]。本文就细胞分选技术及其相关原理、应用和新的技术发展作一综述。
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骨形态发生蛋白2相关小分子活性肽的研究进展
20世纪60年代,Urist将脱钙骨移植于实验动物的肌肉中3~4周之后,意外发现其能诱导异位成骨。因此Urist推断脱钙骨中含有一种可以促进成骨的因子,随后分离出一种非胶原性的骨蛋白( non-collagenous bone proteins),并将其命名为骨形态发生蛋白( BMP)[1]。Urist关于骨形态发生蛋白的发现开启了骨科基础研究新篇章。BMPs是转化生长因子( TGF)-β超家族中的成员,据文献报道,至今已经有超过40种的BMP单体被结晶分离克隆[2]。在所有BMP亚型中,BMP-2是研究为广泛,同时也是公认的成骨活性强的细胞因子[3]。现就近些年来文献报道的关于BMP-2的生物学活性、分子结构、信号转导和相关小分子活性肽的研究等方面作一综述。
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亨廷顿病转基因动物模型研究进展
HD亨廷顿蛋白(htt)的发现使得建立与人类亨廷顿病(HD)有相似遗传基础的动物模型成为可能[1]。随机插入人类htt基因(包含聚谷氨酰胺重复序列)部分片段而构建的转基因动物模型[1],能模拟人类HD发病时的病因和病理特征且能被用来研究HD的治疗策略,现综述目前HD转基因动物模型的研究进展。
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放射性核素骨显像支持下建立乳腺癌骨转移裸鼠莫型
目的 建立人乳腺癌骨转移裸小鼠模型。方法 采用人乳腺癌骨高转移细胞株MDA-MB-231BO,运用细胞悬液浓度0.8×107/ml、1.0×107/ml进行左心室注射,放射性核素骨显像和X线分别检测建立的人乳腺癌骨转移裸鼠模型。观察两组裸小鼠造模后的生存时间、体质量下降率,及骨转移程度与各部位转移率。结果 在两组裸小鼠体内均建成了乳腺癌骨转移模型;1.0×107/ml组裸鼠生存时间显著低于0.8×107/ml组(P<0.01),体质量下降率显著高于0.8×107/ml组(P<0.05);1.0×107/ml组骨转移程度高于0.8×107/ml组,1.0×107/m1组肿瘤细胞数/细胞总数显著高于0.8×107/ml组(P<0.05);1.0 × 107/m1组转移部位数高于0.8×107/ml组;放射性核素骨显像的检出率为100%。结论 核素骨显像在裸鼠骨转移方面具有早期诊断意义;浓度为0.8×107/ml人乳腺癌骨高转移细胞株MDA-MB-231BO可以成功的建立乳腺癌骨转移裸鼠模型,完整地模拟了乳腺癌骨转移患者的自然临床病理过程。
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小型猪激光焊接重建硬膜缺损模型
目的 探讨建立小型猪激光焊接重建硬膜缺损模型的方法。方法 将10头小型猪随机分为两组。额顶部剪除约1 cm×2 cm硬膜形成缺损,自体颞肌筋膜采用激光焊接进行重建。术后10 min和2周检查焊接组织水密性并测量爆裂压力。结果 重建组织均无脑脊液渗出。术后10 min和2周的爆裂压力[分别为(25.60±9.13)mm Hg(1mmHg=0.133 kPa)和(198.60±99.75) mm Hg]远高于颅内压峰值(8.40±1.14) mmHg,差异有统计学意义(P<0.01)。2周组小型猪术后1 ~2d恢复正常,无感染等并发症。结论 小型猪适合建立激光焊接重建硬膜动物模型,手术操作简便,术后动物恢复快,无感染等并发症,重建组织水密性和连接强度好。
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大鼠脑内不同部位海人酸点燃模型的比较
目的 探讨制作简便、效果良好的海人酸(KA)点燃致痫模型方法。方法 立体定向操作下于岛叶、杏仁核和侧脑室局部注射海人酸1.0μl,观察致痫大鼠的行为学和脑电图改变,检测其病理学变化,比较其点燃特征。结果 行为学、脑电图和病理学证实岛叶点燃组与传统致痫(杏仁核、侧脑室)点燃组比较,具有相同的致痫特征;同时,岛叶点燃组初次发作时间为(59.96±4.36)min,静止持续时间为(11.90±0.54)d,明显快于杏仁核组和侧脑室组(P<0.05)。结论 岛叶本身具备致痫潜能,大鼠岛叶海人酸致痫模型具有缩短实验周期、降低实验成本的优势。
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Beagle犬腹腔镜活体供肾-移植模型的建立
目的 探讨Beagle犬腹腔镜活体供肾-移植模型建立的安全性和可行性。方法 8条beagle犬随机分为两组,实验组行腹腔镜左肾供肾切取术,对照组行开放左肾供肾切取术,两组分别行组内同种异体肾移植术并置于左侧髂窝,同时切除白体右肾。统计两组取肾手术时间、术中失血量、热缺血时间、切口长度,肾移植手术时间、术中失血量、供肾动静脉吻合时间等手术指标及术后实验犬肌酐、尿素氮变化情况。结果 实验组腹腔镜供肾切取术均成功完成,无一例中转开腹,其中供肾切取手术时间(61.5±11.0)min,术中失血量(13.9±6.8) ml,供肾热缺血时间(81.4±9.3)s;对照组开放供肾切取术,无一例失败,其中供肾切取手术时间(66.1 ±13.5) min,术中失血量(32.7±4.8) ml,供肾热缺血时间(28.5±5.6)s;8例次同种异体肾移植术,全部成功,受体移植手术时间(87.3±13.9) min,术中失血量(13.5±5.2) ml,动脉吻合时间(19.8±6.7) min,静脉吻合时间(22.8±3.5) min,术后1个月观察期间内,无漏尿、出血、感染等并发症发生,术后第3天实验犬肌酐、尿素氮指标恢复正常。结论 Beagle犬腹腔镜活体供肾-移植模型的建立操作相对简便、容易掌握,成活率高,安全、可靠。
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大鼠杏仁核电刺激癫痫持续状态模型的建立及其自发性反复癫痫发作的研究
目的 建立癫痫持续状态后颞叶癫痫模型,观察大鼠自发性反复发作(SRS)。方法 持续电刺激大鼠杏仁核20 min(单相方波,强度400μA,波宽1 ms,串长100 ms,串隔0.5s,频率60Hz)引发癫痫持续状态(SE),随后进行3h的SE观察,包括大鼠行为表现和脑电变化。SE状态引出后,进行3个月的视频监测,观察大鼠自发性发作的发作情况并进行分组。结果 经过为期3个月的视频观察,出现SRS14只(67%);未出现者7只(33%)。共记录到3~5级发作181次。其中3级发作10次(5.53%),4级发作77次(42.54%),5级发作94次(51.93%)。发作在30次以上者3只;20 ~ 30次者1只;10 ~20次者2只,5~10次者2只;5次以下者6只。约73%的SRS出现在白天(07:00~19:00),74%的继发性全身发作(4、5级发作)出现于白天。结论 成功制备了癫痫持续状态后颞叶癫痫动物模型。
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BK通道对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞内钙离子浓度及凋亡的影响
目的 观察BK通道对脑缺血再灌注损伤神经细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)和对神经元凋亡的影响。方法 将108只SD大鼠随机分为假手术组(SS组,n=36)、脑缺血再灌注组(IR组,n=36)、脑缺血再灌注且脑室内Iberiotoxin(IBTX)处理组(IBTX组,n=36),分别比较各组在不同再灌注时间后神经功能缺损评分、脑梗死面积,利用激光共聚焦显微镜技术测定各组[Ca2+]i浓度,免疫组织化学和TUNEL法分别检测BK通道表达和神经元细胞凋亡。结果 IBTX处理组在再灌注24h后神经功能缺损评分为(2.17±0.44)明显高于IR组(1.83±0.42,P<0.05);脑梗死体积(27.97±5.84)%明显大于SS组(22.83±4.74)%(P<0.05);激光共聚焦显微镜结果显示:IBTX处理组24h点[Ca2+]i为(914.50 ±86.57) nmol/L较SS组(732.09 ±51.30) nmol/L明显升高(P<0.01),TUNEL细胞凋亡检测显示IBTX处理组24h神经细胞凋亡率为(15.20±6.11)%,与IR组(10.49±1.91)%比较差异有统计学意义(P<0.05),免疫组织化学结果显示缺血再灌注损伤后BK通道的表达增加,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 在缺血状态下,BK通道对神经细胞具有保护作用,其机制很可能是通过降低神经细胞内钙离子浓度和减少细胞的凋亡。
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共轭三烯酸对人胶质瘤U251细胞的增殖抑制作用
目的 探讨共轭三烯酸(TCLA)对人胶质瘤细胞的增殖抑制作用及作用机制。方法 用噻唑蓝(MTT)比色法、克隆形成试验、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺人试验研究TCLA对人脑胶质瘤细胞的增殖抑制作用;Hoechst 33342/PI双染法、流式细胞术检测细胞凋亡指数和周期分布;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测凋亡相关基因腺苷二磷酸核糖转移酶1(ADPRTL1)、细胞色素P4501A1( CYP1A1),过氧化物酶增殖体激活受体-γ(PPAR-γ)的表达。结果 共轭三烯酸对人胶质细胞瘤(U251)有明显抑制作用,呈剂量-时间-效应关系(P<0.05)。克隆形成下降,40 μmol/LTCLA可完全抑制克隆形成。BrdU标记从(91.6±3.6)%下降到(14.4±4.4)%(P<0.05),Hoechst 33342/PI双染试验,凋亡细胞增加(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,细胞凋亡指数从(7.3±1.2)%升高到(34.2±2.4)%(P<0.05),Go/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少(P<0.05);RT-PCR结果显示,凋亡相关基因ADPRTL1、CYP1 A1、PPAR-γ mRNA表达增强(P<0.05)。结论 TCIA对人脑胶质瘤细胞具有增殖抑制和凋亡诱导作用,其作用机制可能与抑制肿瘤细胞DNA合成、细胞周期阻滞、上调凋亡相关基因(ADPRTL1、CYP1A1、PPAR-γ)表达有关。
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体外调节Th1/Th2平衡治疗脑胶质瘤
目的 观察外源性细胞因子白细胞介素( IL)-2、干扰素(IFN)-γ和IL-4单克隆抗体(McAb)、IL-10 McAb在体外能否促使Th2型细胞因子分泌优势向Th1型逆转,抑制胶质瘤细胞生长。方法 体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,加入外源性细胞因子共同孵育,光学显微镜观察细胞形态学变化,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Th1/Th2类细胞因子表达变化。结果 实验组较对照组细胞体积变小,生长密度低,细胞数目少;实验组与对照组比较细胞增殖抑制率分别为(26.41 ±3.60)%,其A值与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。对照组细胞只表达Th2类细胞因子,Th1类细胞因子表达缺如,实验组IFN-γ表达增加,IL-4和IL-10表达减弱,但是未见IL-2表达。结论 外源性细胞因子能够抑制脑胶质瘤细胞的生长,促进Th2型细胞因子分泌优势向Th1型逆转。
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胶质瘤干细胞趋化神经干细胞迁移及其机制研究
目的 观察神经干细胞( NSC)向胶质瘤干细胞(GSC)及其分化细胞的迁移能力,探讨其趋化机制。方法 干细胞条件培养U251和3例原代胶质瘤干细胞,以流式细胞术和Western blot对其鉴定;Transwell小室法检测GSC和其分化细胞条件培养液(CM)对NSC迁移的趋化能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测CM中血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌水平,并以表皮生长因子(EGF)、bFGF为对照分析CM对NSC的化学趋化作用;进一步以Dio和Dil分别标记NSC和GSC,体外混合培养观察NSC向GSC的迁移、以及对肿瘤干细胞球生长的影响。结果 干细胞培养条件下的胶质瘤干细胞球,高表达干细胞标志物Nestin和/或CD133( 11.02%~ 33.55%);分化后干细胞标志物表达下降,分化标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达增加(P<0.05);GSC与其分化细胞比较,分泌高水平的趋化因子VEGF和bFGF(P <0.05),并对NSC有高度趋化能力;体外混合接触培养也显示NSC向肿瘤干细胞球的迁移和包绕,并且能够显著抑制肿瘤干细胞球的生长(P<0.05)。结论 GSC体外可趋化NSC向其迁移,其趋化作用较分化的肿瘤细胞更为显著,并且与其分泌高水平的生长因子有关;向肿瘤干细胞球迁移的NSC可抑制其体外生长。
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RNA干扰沉默c-myc基因对胶质瘤血管内皮生长因子表达的影响
目的 观察c-myc癌基因在体外对胶质瘤细胞血管内皮生子因子(VEGF)表达的影响。方法 构建以c-myc基因为靶向的shRNA干扰质粒pCMYC,同时构建pHK质粒作为阴性对照,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组细胞中c-myc及VEGF mRNA水平的表达变化,采用免疫细胞化学法及Western blot法分别检测3组细胞中c-myc及VEGF蛋白的表达。结果 (1) IN500Δ-pCMYC细胞组c-myc与VEGF mRNA表达降低(0.273±0.028,0.443 ±0.048),与IN500Δ细胞组(1.185±0.145,1.116±0.072)及IN500Δ-pHK细胞组(1.098±0.128、1.208±0.133)比较差异均有统计学意义(P<0.01)。(2)免疫细胞化学染色结果显示,IN500Δ-pCMYC细胞组c-myc与VEGF阳性细胞表达率均显著降低,为(24.52 ±4.39)%及(23.52±3.44)%,与IN500Δ及IN500Δ-pHK细胞组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)Western blot法检测结果显示IN500Δ-pCMYC细胞中c-myc与VEGF的蛋白表达降低(0.221±0.041、0.284±0.025),与IN500Δ细胞组(1.821±0.191、1.531±0.213)及1N500Δ-pHK细胞组(1.650±0.110、1.820±0.122)比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 沉默c-myc基因能够抑制胶质瘤中VEGF的表达,从而降低肿瘤组织内的血管生成。
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LRIG3基因过表达对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原和Ki-67表达的影响
目的 探讨过表达LRIG3基因对神经胶质瘤细胞株U251与U87增殖及增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67表达的影响及其机制。方法 用携带LRIG3过表达特异性序列和只含空白载体的质粒用慢病毒法感染胶质瘤细胞株U251与U87,筛选稳定株,分别分成实验组和对照组,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测各组细胞LRIG3表达的变化,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测病毒感染后对胶质瘤细胞株U251与U87增殖的影响,用免疫组织化学链霉亲和素生物素复合物(SABC)法分别检测各组细胞中PCNA和Ki-67的表达差异。结果 LRIG3过表达组细胞中LRIG3 mRNA水平与对照组比较分别升高67.6%( U251)和79.9% (U87),LRIG3蛋白表达水平分别升高62.3%(U87)和91.0%( U251)。MTT法结果显示两实验组细胞增殖率均低于相应对照组。U251细胞对照组PCNA阳性率为(47.81 ±4.67)%,实验组为(27.49±3.17)%,U87细胞对照组PCNA阳性率为(55.50±4.01)%,实验组为(33.60±4.82)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。U251细胞对照组中Ki-67的阳性率为(48.50±6.11)%,实验组为(24.30±3.76)%,U87细胞对照组Ki-67阳性率为(55.20±4.19)%,实验组为(23.50±4.60)%,差异均有统计学意义(P<0.0l)。结论 LRIG3基因过表达可减少胶质瘤细胞的增殖。
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脑积水患者手术前后脑脊液中谷氨酸和一氧化氮水平的变化
目的 观察脑积水患者脑脊液内谷氨酸(Glu)和一氧化氮(NO)水平在手术前后的动态变化。方法 收集36例急性脑积水和21例慢性脑积水患者在接受脑脊液外引流或分流手术前后脑脊液标本,用高效液相色谱仪检测Glu浓度、硝酸还原酶法测NO浓度。对照组28例患者脑脊液用同样方法检测。结果 手术前,急性脑积水患者脑脊液中Glu和NO浓度分别为(8.17±1.06)、(38.47±3.90) μmol/L,慢性脑积水患者脑脊液中Glu和NO浓度分别为(6.23 ±0.97)、(33.18 ±2.75) μmol/L,均明显高于对照组,手术后Glu和NO浓度均有不同程度下降,其下降程度与患者的手术疗效呈正相关。结论 脑脊液中高水平的Glu和NO可能参与了脑积水患者的病理生理过程,动态测定脑脊液中Glu和NO浓度有助于判断患者的手术疗效和预后。
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深入研究胶质瘤分子病理和影像学特征的临床指导意义
胶质瘤是常见的中枢神经系统原发性肿瘤,其中恶性度较高的是多形性胶质母细胞瘤。和其他大部分脑部肿瘤比较,它的突出特点在于对周围脑组织的侵袭性生长方式。因为侵袭性生长的特性,胶质瘤很难治愈。尽管有一些低度恶性胶质瘤(WHOⅡ级)的患者有数年的生存期,但常常在发展为高度恶性肿瘤(WHO Ⅲ/Ⅳ级)后终导致死亡。因此,对胶质瘤侵袭性生长方式的分子病理学特点及影像学的研究将极大改善目前治疗观点。
年 | 期数 |
2019 | 01 02 |
2018 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2017 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2016 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2015 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2014 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2013 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2012 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2011 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 |
2010 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2009 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2008 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2007 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2006 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2005 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2004 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2003 | 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 |
2002 | 01 02 03 04 05 06 |
2001 | 01 02 03 04 05 06 |
2000 | 01 02 03 04 05 06 |
1999 | 01 02 03 04 05 06 |
1998 | 01 02 |